Desenvolvimento de vetores não virais para entrega gênica baseados na cadeia leve de dineína Rp3

Autor(es)

Marianna Teixeira de Pinho Favaro

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2012-11-07

Membros da banca

Adriano Rodrigues Azzoni; Carlos Augusto Pereira; Maricilda Palandi de Mello

• Orientador: Adriano Rodrigues Azzoni; Anete Pereira de Souza

Resumo

Entrega gênica é uma estratégia muito promissora com grande potencial médico, que consiste na introdução de ácidos nucléicos exógenos, e pode ser aplicada tanto para terapia gênica quanto para vacina de DNA. Contudo seu uso ainda é limitado pela falta de um vetor de entrega ideal, que seja ao mesmo tempo eficiente e seguro. Embora muito mais eficientes, os vetores virais ainda despertam preocupações a respeito de sua segurança. Por outro lado, vetores não-virais são muito mais seguros e facilmente manipuláveis, ainda que menos eficientes. Neste contexto, "vírus artificiais" são uma opção interessante, uma vez que são vetores não-virais desenvolvidos para explorar a arquitetura celular de uma forma eficiente, superando uma série de barreiras físicas, enzimáticas e difusionais, mas mantendo a segurança do DNA plasmidial (pDNA). O principal objetivo da abordagem estudada é explorar os motores moleculares, como dineína, para transportar cargas da periferia para o centrossoma de células de mamíferos através da rede de microtúbulos. Para isso, a cadeia leve Rp3 da dineína foi fusionada a um domínio de interação com DNA (DNA-binding) no N-terminal, e ao peptídeo membrano-ativo TAT no C-terminal. A proteína, nomeada T-Rp3, tem ainda um His-Tag. Esta proteína recombinante construída contém então diferentes domínios para promover condensação do pDNA (DNA binding), para facilitar a entrada na célula e no núcleo (TAT) e para aumentar o escape endossomal (His- Tag), além da própria Rp3 que deve assistir no tráfego intracelular, agindo assim diretamente na maioria dos principais obstáculos intracelulares enfrentados pelos vetores. Estudos de expressão indicam que a proteína recombinante é corretamente expressa em E. coli BL21(DE3). Experimentos de mobilidade em gel de agarose ("gel retardation assay") combinados com estudos de espalhamento de luz e potencial zeta indicam que a proteína efetivamente interage com o pDNA, formando complexos que são pequenos (~95 nm) e positivamente carregados (+28 mV na relação molar de pDNA:proteína 1:8000). Ensaios de transfecção em cultura de células HeLa indicam que T-Rp3 atinge uma eficiência de transfecção muito maior que a proteína nuclear Protamina (aqui usada como controle), chegando a ser 900 vezes maior a expressão relativa do gene repórter na relação molar de pDNA:proteína 1:8000. Na comparação com Lipofectamina 2000TM, um reagente bem caracterizado de transfecção aqui usado como controle positivo, a T-Rp3 demonstrou atingir níveis similares de eficiência, com a vantagem adicional de ser menos citotóxica, conforme evidenciado em ensaios de viabilidade celular. Transfecções realizadas na presença da droga Nocodazol indicam que a eficiência da T-Rp3 depende fortemente da rede de microtúbulos, uma vez que a eficiência é reduzida em 92% quando os microtúbulos estão despolimerizados. A partir das transfecções na presença da droga Cloroquina, pudemos observar que o aprisionamento no endossomo ainda é um fator limitante. Finalmente, ensaios de cromatografia de afinidade realizados com o domínio da cadeia intermediária de dineína imobilizado indicam que a cadeia leve recombinante T-Rp3 mantém a capacidade de interagir com o complexo da dineína. Analisados em conjunto, os resultados apontam para uma grande participação da rede de microtúbulos na eficiência de transfecção de T-Rp3, objetivo inicial deste trabalho (AU)

• Processo FAPESP: 09/12635-5 - Desenvolvimento de Vetores Não-Virais para Terapía Gênica e Vacinação por DNA: Superação das Barreiras à Entrega Gênica
• Beneficiário: Marianna Teixeira de Pinho Favaro
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado