Estudos bioquímicos e estruturais de uma metaloprotease isolada da peçonha de Bothrops pirajai

Autor(es)

Carolina Petri Bernardes

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Ribeirão Preto.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (PCARP/BC)
• Data de defesa: 2012-12-07

Membros da banca

Suely Vilela; Luciana Simon Pereira Crott; Silvana Marcussi

• Orientador: Suely Vilela

Resumo

As peçonhas de serpentes são misturas complexas de moléculas bioativas resultando em um produto biológico eficiente que tem como principais objetivos a promoção de imobilização, morte e digestão inicial de presas. As metaloproteases e as serinoproteases estão entre as principais enzimas responsáveis por afetar o sistema hemostático por diferentes mecanismos. O presente trabalho teve como objetivo o isolamento e a caracterização bioquímica, funcional e estrutural de uma metaloprotease da classe P-I a partir da peçonha de Bothrops pirajai. A metaloprotease foi isolada utilizando três passos cromatográficos: exclusão molecular em Sephacryl S-200, troca iônica em CMSepharose e afinidade em Blue Sepharose, resultando na metaloprotease denominada BpirMP. A massa molecular da enzima foi determinada por espectrometria de massas (23,15 kDa), e conforme visualizado por SDS-PAGE, a molécula apresentou cadeia polipeptídica única. A determinação da sequência parcial de aminoácidos e o alinhamento múltiplo com sequências depositadas em bancos de dados mostrou alta identidade (70-90%) com outras metaloproteases da classe P-I de peçonhas de serpentes. A molécula possui a sequência de consenso HELGHNLGMEH, bem como a sequência de CVM, que caracterizam a superfamília das metaloproteases \"metzincinas\". A enzima mostrou ação sobre o fibrinogênio, degradando as cadeias Aα e Bβ, sendo capaz também de degradar coágulos de fibrina e de sangue in vitro, dissolvendo completamente o coágulo de sangue na maior dose testada. A enzima não apresentou atividade coagulante sobre plasma sanguíneo. A atividade proteolítica da metaloprotease sobre a azocaseína foi avaliada em diferentes condições de pH e temperatura, mostrando que a enzima tem a sua atividade reduzida em pHs ácidos e em temperaturas superiores a 60 ºC. A atividade proteolítica foi inibida por agentes quelantes como EDTA, EGTA e 1,10- fenantrolina e por agentes redutores como β-mercaptoetanol e DTT. Inibidores específicos de serinoproteases (benzamidina, leupeptina e aprotinina) não apresentaram efeito sobre a atividade proteolítica da BpirMP. A enzima mostrou-se hemorrágica, apresentando dose hemorrágica mínima (DHM) de 50 µg. BpirMP hidrolisou componentes da membrana basal tanto in vitro como in vivo, degradando preferencialmente laminina e nidogênio. A metaloprotease apresentou efeitos sobre processos inflamatórios como a indução de edema e dor, promovendo um pronunciado recrutamento de neutrófilos e aumento significativo na quantidade total de leucócitos no exsudato inflamatório. A avaliação da participação de diferentes mediadores inflamatórios na indução do edema e hiperalgesia indicaram o envolvimento de metabólitos do ácido araquidônico e histamina. O efeito citotóxico induzido pela metaloprotease foi avaliado sobre o músculo gastrocnêmico de camundongos e também nos tecidos cardíaco, renal, pulmonar e esplênico, apresentando degeneração das fibras musculares e infiltrado leucocitário. Os resultados demonstram que a BpirMP é uma metaloprotease de baixa massa molecular, com baixa atividade hemorrágica, pertencente à classe P-I, descrita pela primeira vez para a espécie B. pirajai. A caracterização da peçonha de Bothrops pirajai foi realizada por meio de técnicas proteômicas para determinar a sua composição proteica. As proteínas foram separadas por RP-HPLC, seguido por SDS-PAGE, digestão tríptica \"in-gel\" e identificação por espectrometria de massa por MALDI-TOF/TOF, e atribuição de famílias de proteínas conhecidas por homologia. Proteínas pertencentes a sete famílias foram encontradas na peçonha de B. pirajai, incluindo grande abundância de fosfolipases A2 (~40%) e metaloproteases (~20%). (AU)

• Processo FAPESP: 07/08361-1 - Caracterização funcional e estrutural de uma metaloprotease não-hemorrágica com atividades antitumoral e microbicida isolada do veneno de Bothrops pirajai
• Beneficiário: Carolina Petri Bernardes
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto