Papel de miRNAs na regulação da via de produção de poliaminas/NO em macrófagos derivados de THP-1 infectados com Leishmania amazonensis

Autor(es)

Juliane Cristina Ribeiro Fernandes

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: São Paulo.
• Instituição: Faculdade de Medicina (FM/SBD)
• Data de defesa: 2023-05-02

Membros da banca

Lucile Maria Floeter Winter; Hiro Goto; Marcelo Alves da Silva Mori

• Orientador: Lucile Maria Floeter Winter; Sandra Marcia Muxel

Resumo

Leishmania amazonensis é um protozoário que causa principalmente leishmaniose cutânea em humanos. O aminoácido arginina exerce papel central na sobrevivência do parasita no macrófago e no estabelecimento da infecção ao suprir ornitina, via arginase 1, precursor da via de poliaminas, que são moléculas essenciais para a proliferação do parasita. Por outro lado, arginina pode levar à produção de óxido nítrico (NO) via óxido nítrico sintase 2 (NOS2), principal molécula efetora leishmanicida. Ao contrário do que ocorre em macrófagos murinos, estudos apontam ausência de atividade de NOS2 em macrófagos humanos. Diversos trabalhos demonstraram a importância de microRNAs na regulação da resposta imune na infecção por diferentes espécies de Leishmania e hospedeiros. Neste estudo, investigamos a via de poliaminas/NO e regulações mediadas por miRNAs que alteram a infectividade de L. amazonensis em macrófagos humanos derivados da linhagem monocítica THP-1. Inicialmente, quantificamos o perfil de expressão de miRNAs envolvidos na resposta inflamatória e identificamos a modulação positiva de miRNAs pertencentes à família miR-372/373/520, que compartilham a sequência seed AAGUGCU, responsável pelo reconhecimento do mRNA alvo. Essa sequência é idêntica à seed do miR-294 murino, previamente demonstrado como um importante fator de promoção da infecção ao reduzir o mRNA Nos2. Estudos em colaboração demonstraram a regulação positiva desses miRNAs também em THP-1 infectada com L. braziliensis e L. infantum e em soro de pacientes com leishmaniose visceral. Nossos resultados mostraram que a infecção de L. amazonensis nocaute de arginase é reduzida após 24h e correlaciona com a ausência de regulação dos miRNAs estudados. Para entender a importância desses miRNAs na infecção por L. amazonensis, inibimos os miR-372, miR-373 e miR-520d sozinhos ou combinados e observamos que a inibição de miR-372, mas não miR-373 ou miR-520d sozinhos, foi capaz de reduzir a proporção de macrófagos infectados e o número de amastigotas por macrófagos. A inibição simultânea dos 3 miRNAs reduziu ainda mais a infecção, enquanto o uso de mímicos aumentou a infecção, indicando um mecanismo sinergístico dos miR-372/373/520d na promoção da infectividade. Esses miRNAs compartilham mRNAs-alvo putativos que codificam proteínas envolvidas na tomada de aminoácidos, metabolismo de poliaminas e ciclo da ureia, incluindo o principal transportador de arginina do macrófago CAT2, cujo mRNA é aumentado com a inibição simultânea dos miR-372/373/520d. Por outro lado, o sítio alvo de NOS2 de camundongos não é conservado no 3UTR de humanos. De forma geral, nossos resultados mostraram baixa modulação da via de NO/poliaminas a nível transcricional e, para acessar o fenótipo do macrófago, realizamos quantificação a nível de metabólitos utilizando metabolômica baseada em espectrometria de massas. Nossos dados mostraram que a infecção aumenta a produção de componentes do ciclo da ureia e putrescina, enquanto a inibição dos miR-372/373/520d reduz a produção de putrescina, espermina e tripanotiona. Nossos resultados evidenciam que a corregulação da família miR-372/373/520d na infecção por Leishmania atua na regulação de genes envolvidos no metabolismo de L-arginina, culminando na produção de poliaminas e favorecendo o estabelecimento e a manutenção da infecção. Os mecanismos moleculares descritos podem ser base para o desenvolvimento de terapias voltadas ao hospedeiro (AU)

• Processo FAPESP: 17/21906-9 - Papel de miRNAs na regulação da via de produção de poliaminas/NO em macrófagos derivados de THP-1 infectados com Leishmania amazonensis
• Beneficiário: Juliane Cristina Ribeiro Fernandes
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto