Uma perspectiva sobre as modificações pós-traducionais em toxinas de venenos do gênero Bothrops: identificação proteômica de sítios específicos de N-glicanos e cisteínas

Autor(es)

Débora Andrade Silva

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: São Paulo.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Conjunto das Químicas (IQ e FCF) (CQ/DBDCQ)
• Data de defesa: 2021-08-04

Membros da banca

Solange Maria de Toledo Serrano; Giuseppe Palmisano

• Orientador: Solange Maria de Toledo Serrano

Resumo

Venenos de serpentes são misturas complexas de proteínas e peptídeos, utilizados para predação e defesa, que surgiram durante o desenvolvimento da ordem Squamata e posteriormente evoluíram de modo variável no grupo das cobras avançadas. A variabilidade de suas composições pode ser observada em todos os níveis taxonômicos, entretanto, os fatores que dirigiram e selecionaram tais características ainda são discutidos. Modificação pós-traducional (PTM) é um dos mecanismos envolvidos na geração de proteoformas de proteínas nos venenos. As PTMs mais conhecidas são glicosilação de proteínas, oligomerização de cadeias polipeptídicas, processamento proteolítico e formação de pontes de dissulfeto. Neste estudo, identificamos sítios de N-glicosilação e peptídeos contendo Cys em proteínas de venenos do gênero Bothrops (B. alcatraz, B. cotiara, B. fonsecai, B. insularis, B. jararaca, B. jararacussu e B. moojeni) usando espectrometria de massas. No capítulo 1, a análise de N-glicosilação em proteínas foi realizada por proteólise com tripsina, aliada ao enriquecimento de glicopeptídeos por TiO2 e cromatografia de interação hidrofílica. As frações enriquecidas com glicopeptídeos foram divididas em duas partes: (i) para N-desglicosilação enzimática e análise por LC-MS/MS, e (ii) para análise direta de peptídeos N-glicopeptídeos intactos por LC-MS/MS. Os resultados revelaram a ocorrência de um alto nível de heterogeneidade na ocupação de sítios de N-glicosilação e confirmaram o repertório variável de N-glicanos de proteínas de venenos de Bothrops. No capítulo 2, exploramos a presença de resíduos de cisteína livres nas proteínas desses venenos e realizamos a quantificação relativa das proteínas utilizando marcação com tandem mass tags (TMT). As proteínas foram inicialmente marcadas com Netilmaleimida e, após proteólise com tripsina, as misturas de peptídeos foram marcadas com TMTs diferentes, combinadas e os peptídeos contendo cisteína foram enriquecidos com tiol-Sepharose. Ambas as frações, não ligada e ligada à resina, foram fracionadas por cromatografia de fase reversa em alto pH e submetidas à análise por LC-MS/MS. Os resultados revelaram a presença de resíduos de cisteína livres em posições de proteínas que sabe-se estarem envolvidas na formação de pontes de dissulfeto, indicando que pode haver mais de um padrão de pontes de dissulfeto em proteínas de veneno Bothrops. Ainda, a quantificação relativa de proteínas mostrou abundância diferencial na maioria das classes de toxinas, e uma análise de agrupamento hierárquico classificou os sete venenos em três agrupamentos, em um padrão semelhante ao observado na filogenia dessas serpentes. (AU)

• Processo FAPESP: 16/16935-7 - Uma perspectiva sobre as modificações pós-traducionais em toxinas de venenos do gênero Bothrops: identificação proteômica de sítios específicos de N-glicanos e cisteínas.
• Beneficiário: Débora Andrade Silva
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado