Estudos bioquímicos e estruturais das septinas humanas SEPT3 e SEPT5 e identificação de parceiros protéicos

Resumo

Septinas pertencem a uma família de proteínas que se liga a GTP e que são formadas basicamente por três regiões: um domínio N-terminal variável e rico em prolina, um domínio central de ligação a GTP e um domínio C-terminal predito coiled-coil. Em humanos foram identificadas 13 septinas humanas que estão sendo relacionadas com diversas funções celulares, com doenças neurodegenerativas (mal de Parkinson e de Alzheimer) e com alguns tipos de câncer. Nesta proposta, objetivamos clonar, expressar e purificar as septinas humanas SEPT3 e SEPT5 inteiras, seus domínios de ligação à GTP e o domínio GTP com C-terminal, para subseqüentes estudos de estabilidade estrutural utilizando cromatografia de exclusão molecular, e técnicas espectroscópicas, como fluorescência e dicroísmo circular. Investigaremos a capacidade de formação de amilóides destas proteínas utilizando marcadores fluorescentes específicos como ThT (Thioflavin T). Estudos de atividade serão realizados a fim de caracterizar o domínio de ligação à GTP. A técnica de duplo híbrido será usada para screen de duas bibliotecas de cDNA (cérebro fetal humano e leucócitos), usando como isca SEPT5 a fim de buscar parceiros protéicos desta proteína, visando contribuir com a caracterização funcional destas moléculas. Como resultados preliminares já temos a clonagem e expressão heteróloga de SEPT3 inteira e suas versões truncadas de forma solúvel, o que nos permitiu purificá-las em condições nativas. Estudos de estabilidade estrutural por dicroísmo circular já estão em andamento. (AU)