Implementação da técnica de qRT-PCR para o monitoramento de cianobactérias e microcistinas em reservatórios de água

Resumo

Métodos rápidos e sensíveis para a detecção das cianobactérias e suas toxinas em estações de abastecimento de água e em programas de monitoramento de mananciais são de fundamental interesse para a prevenção dos efeitos adversos causados por estas toxinas na saúde humana e animal. Atualmente, a identificação e contagem de células de cianobactérias por microscopia ótica e análises químicas ou imunológicas das toxinas são usadas em monitoramentos. Entretanto, recentemente, métodos moleculares estão sendo desenvolvidos e propostos para o diagnóstico rápido e sensível da presença de cianobactérias tóxicas. Este projeto objetiva detectar e quantificar cianobactérias e a produção de microcistinas por suas células usando a técnica de PCR Quantitativo em Tempo Real (qRT-PCR). Para isso, serão desenvolvidos oligonucleotídeos específicos tendo como alvo a região cpcBA-IGS do operon da ficocianina e os genes mcyA, mcyD ou mcyE, os quais encontram-se envolvidos na biossíntese de microcistinas. A padronização da metodologia será feita usando cianobactérias isoladas, mantidas na coleção de culturas do CENA/USP e a especificidade dos iniciadores será verificada após análise BLAST, usando seqüências previamente depositadas em banco de dados público. Os resultados da quantificação das cianobactérias serão confirmados a partir da contagem de suas células, seguindo a técnica de contagem de Utermöhl. Posteriormente, essa metodologia será aplicada em amostras ambientais de água que serão coletadas no reservatório de Salto Grande, Americana, SP, conhecido por apresentar florações tóxicas de cianobactérias. Adicionalmente, a detecção das microcistinas será feita por meio de ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) e Q-TOF (Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry). (AU)