Aplicação da técnica de qPCR para o monitoramento de cianobactérias e suas toxinas em reservatórios de água

Resumo

Métodos rápidos e sensíveis para a detecção precoce das cianobactérias potencialmente tóxicas, em estações de abastecimento de água e em programas de monitoramento de mananciais, são de fundamental interesse para a prevenção dos efeitos causados na saúde de animais e humanos. Atualmente, a contagem de células, identificação de cianobactérias por microscopia óptica e análises químicas ou imunológicas das toxinas são usadas nos monitoramentos. Em anos recentes, métodos moleculares estão sendo desenvolvidos e propostos para o diagnóstico rápido e sensível da presença de cianobactérias tóxicas em diversos ambientes. Este projeto tem por finalidade implementar uma metodologia capaz de acessar e quantificar as cianobactérias mais freqüentes nos reservatórios de água do Estado de São Paulo, bem como detectar o potencial de produção das toxinas microcistinas e cilindrospermopsinas, usando a técnica de PCR Quantitativo em Tempo Real (qPCR). Serão desenvolvidos oligonucleotídeos LUX, marcados com fluoróforo, flanqueando a região cpcBA-IGS do operon da ficocianina (PC) dos gêneros Anabaena, Aphanizomenon, Cylindrospermopsis, Microcystis e Planktothrix. A PCR duplex envolverá a região PC e o domínio da N-methyltransferase do gene da sintetase de microcistinas (mcyA) dos gêneros Anabaena, Microcystis e Planktothrix. Numa segunda abordagem, o gene mcyA será substituído pelo gene mcyE na PCR duplex, capaz de codificar outra sintetase de microcistinas. Para Aphanizomenon e Cylindrospermopsis, considerando uma terceira abordagem, o gene da amidinotransferase (aoaA) será usado para a detecção de cilindrospermopsinas, juntamente com a respectiva região PC. A padronização da metodologia será feita usando linhagens isoladas, mantidas na coleção de culturas do CENA/USP, e a contagem de suas células será feita pela técnica de Utermöhl. Posteriormente, essa metodologia será aplicada em amostras ambientais de água que serão coletadas em reservatórios do Estado de São Paulo, conhecidos por apresentarem florações tóxicas de cianobactérias. A detecção das cianotoxinas também será feita pelo método ELISA (microcistinas) e Q-TOF (microcistinas a cilindrospermopsinas). (AU)