Desenvolvimento de Vetores Não-Virais para Terapía Gênica e Vacinação por DNA: Superação das Barreiras à Entrega Gênica

Resumo

Um dos principais limitantes do desenvolvimento de protocolos mais eficientes de terapia gênica e vacinação com DNA provém da baixa eficiência de transferência gênica por parte de vetores não-virais. Isso surge, principalmente, da dificuldade de transporte do DNA estrangeiro do exterior para o núcleo das células alvo, devido à presença de inúmeras barreiras físicas, enzimáticas e difusionais. O principal objetivo do projeto aqui proposto é o desenvolvimento de vetores não-virais multifuncionais ("virus artificiais") capazes de realizar eficientemente a entrega de material genético (DNA plasmidial, pDNA). Introduzindo-se novos domínios à proteínas de fusão atualmente em estudo por nosso grupo (TcTex-1 e RP3), espera-se avaliar de forma sistemática a capacidade destas proteínas de auxiliar a superação destas barreiras. O aumento da eficiência de entrada na célula e translocação para o núcleo será estudado através da inclusão de domínios "membrano-ativos" (Tat e Penetratina) nestas proteínas. O escape dos vetores retidos em endossomas será avaliado através da utilização de sequências de histidina. O transporte intracelular de pDNA através de microtúbulos será estudado explorando-se a capacidade natural da proteína motora Dineína para o transporte de cargas da periferia para o interior das células. Em todas as etapas do estudo, o número de vetores de pDNA presentes no interior e núcleo das células transfectadas será quantificado através de real time PCR, e a eficiência de transfecção através da expressão dos genes repórteres Luciferase e GFP. Espera-se, dessa forma, levantar informações importantes sobre alguns dos principais mecanismos envolvidos em etapas cruciais do tráfego intracelular de transgenes. Outro resultado esperado é o desenvolvimento de vetores multifuncionais capazes de reduzir a diferença de eficiência existente atualmente entre vetores não-virais e virais.