Estudos estruturais e funcionais do complexo PilZXAC1133-FimXXAC2398 - PilBXAC3239 do fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv citri

Resumo

Este projeto de pós-doutorado tem como principal objetivo aprofundar nossos conhecimentos sobre a estrutura do complexo PilZ-FimX-PilB e sua função no controle do pilus tipo IV em X. axonopodis pv citri. Estes estudos se derivam da estrutura cristalina de PilZXAC1133 e suas interações recentemente determinadas por nós. Durante o andamento deste projeto também pretendemos terminar alguns outros projetos que foram iniciados durante o meu doutorado.Projeto Principal: O complexo PilZ-FimX-PilB: A proteína PilZ, PA2960 de P. aeruginosa, foi descrita por ser necessária na biogênese do pilus do tipo IV (T4P), uma estrutura filamentosa na superfície bacteriana envolvida em diferentes fenótipos bacterianos. Nos últimos anos um grande número de famílias de parálogos de PilZ foram identificados e algumas são receptoras a c-diGMP. Recentemente, nosso grupo determinou a estrutura tridimensional de PilZXAC1133 de X. axonopodis pv citri, Xac (um ortólogo de PA2960). Neste estudo também identificamos importantes interações entre PilZXAC1133 e duas outras proteínas envolvidas na biogênese do T4P: PilBXAC3239, uma ATPase que regula a polimerização do T4P, e FimXXAC2398, uma proteína reguladora da biogênese do T4P com domínios envolvidos em sinalização pelo c-diGMP. A descoberta inédita de dois parceiros de PilZ também envolvidas na biogênese do T4P levantaram hipóteses sobre os mecanismos de regulação do T4P que devem ser exploradas rapidamente. Neste projeto de pós-doutorado, estudos funcionais e estruturais mais aprofundados serão feitos a fim de entender detalhadamente as interações de PilZ com FimX e com PilB e seu papel no controle da função do T4P. Outros projetos que serão terminadosEstrutura do domínio Hpt da RpfC: A resposta fisiológica a densidade celular, ou quorum sensing, (Q.S), em espécies de Xanthomonas é controlada por uma via de sinalização que tem no seu cerne 3 proteínas: RpfF, RpfC e RpfG. Demonstramos que estas 3 proteínas interagem entre si e estamos interessados em entender a base estrutural da via de transdução de sinal que controla o Q.S em Xanthomonas. A RpfC, proteína chave neste mecanismo, possui 4 domínios: i. domínio sensor; ii. histidina quinase, iii. regulador de resposta e iv. histidina fosfotranferase (Hpt). Cristalizamos o domínio HPT da RpfC, mas não obtivemos êxito na determinação da sua estrutura. Pretendemos obter melhores cristais do domínio HPT, utilizando uma nova construção, para uso em novos ensaios de cristalização. Papel de YaeQ em reparo de DNA: Proteínas da família YaeQ são conservadas em muitas espécies bacterianas e a resolução da estrutura de YaeQXAC2396 de Xac por nosso grupo a enquadrou dentro da superfamília de nucleases metalo-dependentes contendo o motivo estrutural PD-(D/E)XK. Esta superfamília inclui enzimas de restrição e proteínas envolvidas em reparo e recombinação de DNA. Dados não publicados do nosso grupo empregando um nocaute gênico de yaeQ em Xac apontam para a provável função de YaeQ no processo de reparo de DNA, consistente com uma função molecular que envolve sua interação com ácidos nucléicos. Pretendemos estender e aprofundar nosso conhecimento sobre as funções da YaeQ e o seu possível papel no processo de reparo de DNA.SufE: O complexo SufS-SufE é um sistema de dois componentes com atividade cisteína desulfarase e está envolvido na biogênese de clusters de Fe-S. SufS catalisa a transferência de um átomo de enxofre de cisteína livre para uma cisteína especifica da sua cadeia, SufS-SH. O grupo -SH é transferido para SufE que o transfere para SufB do complexo ATPase SufBCD onde se combina com íons de ferro para formar centros de Fe-S transientes. Estes centros são transferidos para apoenzimas. Determinamos a estrutura de SufE de Xac e mostramos que SufE aumenta a atividade cisteína desulfarase de SufS. Desta forma, pretendemos depositar a estrutura de SufE e publicar a descrição de sua estrutura e atividade. (AU)