Estudo funcional e estrutural de inibidores de proteases tipo cistatinas identificados em intestino do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

Resumo

Os carrapatos são importantes vetores de doenças para o homem e outros animais vertebrados. O Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um ectoparasito exclusivo de bovinos, sendo responsável pelas infecções causadas por ricketsia, Anaplasma sp, Babesia sp. O R. microplus causa grandes prejuízos à pecuária, o que resulta em perdas consideráveis na produção de carne, couro e leite. No Brasil esse prejuízo alcançou os dois bilhões de dólares. Algumas proteínas como, por exemplo, enzimas e inibidores protéicos já foram identificados e caracterizados na saliva, entretanto pouco se sabe a respeito das proteínas identificadas no intestino do carrapato. Recentemente, foi realizado um transcriptoma de intestino de R. microplus no nosso laboratório, dentre os genes encontrados foi identificado um inibidor de cisteínoproteases da família das cistatinas. Na tentativa de compreender os mecanismos de ação deste inibidor de proteases, a sequencia do fragmento do gene de cistatina será confirmado por clonagem em vetor pGEMT-easy, confirmada a sequencia o mesmo será sub-clonado em vetor de expressão e a proteína expressa em bactéria. A proteína recombinante será produzida e purificada para sua caracterização bioquímica e avaliação da sua seletividade frente diferentes cisteínoproteases, dentre elas a enzima BmCL1, enzima digestiva de R. microplus. De posse da cistatina purificada, iremos realizar os ensaios de cristalográficos na tentativa de resolver a estrutura tridimendimensional, paralelamente, será produzido a Bmcistatina-1 (LIMA et al., 2006) que já foi caracterizada no nosso laboratório assim como a BmCL1 (CLARA et al., 2011 aceito para publicação), para realização de ensaios de cristalografia do inibidor e do complexo inibidor-enzima, a fim de aumentar a probabilidade de obter cristais de proteína, o que permitirá a difração e possivelmente a resolução da estrutura tridimensional de uma cistatina de carrapato, pelo nosso grupo.