Estudo das vias de sinalização desencadeadas pela interação de proteínas de micronema de Toxoplasma gondii com glicanos dos receptores do tipo Toll 2 e 4

Resumo

Toxoplasma gondii é um protozoário coccídio intracelular obrigatório capaz de parasitar uma ampla gama de espécies hospedeiras. A região apical do parasito é rica em organelas que, em função dos produtos liberados, estão envolvidas no processo de adesão e invasão da célula hospedeira. Algumas das proteínas liberadas por micronemas (MICs) possuem domínios adesivos essenciais para a virulência do parasita; elas podem associar-se entre si na superfície do taquizoíta, formando complexos, como o TgMIC1/MIC4/MIC6. Demonstramos anteriormente que o subcomplexo TgMIC1/MIC4 liga-se à lactose e estimula macrófagos a secretar IL-12. A presença de glicanos associados a TLR2 e TRL4 motivou a hipótese de que eles correspondessem a alvos de reconhecimento pelos domínios de reconhecimento de carboidratos (CRD) de proteínas de micronema de T.gondii. Essa hipótese se confirmou através de estudos recentes, nos quais formas recombinantes de TgMIC1 e TgMIC4 foram utilizadas para estimular células HEK293 transfectadas com TLR4 ou TLR2; constatou-se que rTgMIC1 e rTgMIC4 ativam TLR4 e TLR2, em presença ou ausência de co-receptores e moléculas acessórias. Alternativamente, macrófagos derivados de medula óssea de camundongos WT, estimulados com rTgMIC1 e rTgMIC4, mostraram-se capazes de produzir elevados níveis de citocinas pró-inflamatórias, produção esta dependente de TLR2 e TLR4, sendo mais profundamente afetada na ausência de TLR4. Com base nesses dados preliminares, definimos o objetivo do presente estudo: caracterizar a interação de TgMIC1 e TgMIC4 com N-glicanas presentes em TLR2 e TLR4, bem como a influência das MICs na ativação e regulação das vias de sinalização disparadas por esses receptores em macrófagos. Para tanto, macrófagos derivados da medula óssea de animais WT, DKO (TLR2-/- e TLR4-/-), MyD88-/-, TRIF-/- e TRAF6-/- serão estimulados com TgMIC1/4 (5µg/ml), rTgMIC1 (5µg/ml) e rTgMIC4 (5µg/ml), visando avaliar a ativação celular através da liberação de citocinas pró-inflamatórias. Dessa maneira, poderemos confirmar a ocorrência de interação das MICs com os receptores do tipo toll 2 e 4, bem como verificar se a ausência de moléculas adaptadoras, associadas com a sinalização intracelular, afeta a liberação de citocinas por macrófagos. Subsequentemente, avaliaremos se essa interação decorre do reconhecimento de N-glicanas de TLR2 e TLR4, utilizando técnicas de western blot e de inibição com açúcar específico. Uma vez identificada a ocorrência de interação e ativação celular, examinaremos a expressão de co-receptores associados a TLR2 e TLR4, bem como, a ativação e/ou regulação de moléculas das vias de sinalização após a interação de proteínas de micronema de T.gondii com TLR2 e TLR4.