Caracterização funcional da proteína gigante de Trypanosoma brucei

Resumo

Nas últimas décadas os tripanossomatídeos, em especial o Trypanosoma brucei tem sido usado como modelo experimental para estudos celulares, bioquímicos e moleculares considerando sua citoarquitetura e estruturas particulares como cinetoplasto e flagelo. O T. brucei é um protozoário unicelular de grande importância na saúde visto que este é o agente etiológico da doença do sono (Tripanossomíase Africana Humana). Em todos os gêneros da família Tripanosomatidae, proteínas gigantes foram descritas como uma nova classe de proteínas de alta massa molecular (1000-4000 kDa) as quais, além do papel estrutural, podem estar implicadas na organização e regulação do citoesqueleto e seus constituintes. Entretanto, os fatores que interagem com estas proteínas permanecem desconhecidos e pouco se sabe sobre as proteínas gigantes de tripanossomatídeos patogênicos. Este projeto tem como objetivo caracterizar celular, bioquímica e molecularmente a proteína gigante de T. brucei, ainda desconhecida, e determinar o seu papel funcional na biologia do parasito. Para isso, iremos buscar a sequência parcial de aminoácidos da proteína gigante por espectrometria de massas (MS), no genoma deste organismo. Com o conhecimento da sequencia proteica, clonaremos e expressaremos os domínios específicos desta proteína para posteriormente produzir anticorpos para os ensaios de imunofluorescência, immunoblotting, co-imunoprecipitação e através de pull-down identificaremos outros elementos do citoesqueleto que interagem com a proteína gigante. Além disso, avaliaremos in vivo a funcionalidade desta proteína por meio de RNA de interferência, um modelo bem descrito e bastante utilizado em T. brucei, permitindo inferir a atividade da proteína gigante e seu papel no parasito.