Busca de ligantes do sindecam-1 utilizando abordagem de proteômica quantitativa

Resumo

Sindecanos são uma família de proteoglicanos de superfície celular que estão envolvidos em inúmeros processos biológicos, como migração, proliferação e adesão. Estudo do nosso grupo mostra que o sindecam-1 foi encontrado na forma solúvel em carcinoma de células escamosas (SCC-9) quando tratadas com forbol-ester (PMA). Esse aumento na forma solúvel foi associado com diminuição do sindecam-1 ligado à membrana. Interessantemente, essas células apresentaram maior migração e menor adesão celular quando comparada ao controle sem tratamento. Uma nova informação observada nesse estudo foi que o peptídeo derivado do sindecam-1 também foi encontrado em maior abundância nas mesmas células, principalmente quando tratadas com PMA. Esse peptídeo por sua vez foi capaz de induzir migração em células HaCaT e SCC-9. Assim, de acordo com os dados da literatura e os dados mostrados no nosso estudo, acredita-se que, entre outros, dois mecanismos estejam regulando a migração celular no que se refere à sinalização via sindecam-1: a perda do sindecam-1 da membrana como também a sinalização realizada pelo peptídeo. Dessa forma, esse projeto visa continuar esse estudo do nosso grupo com o objetivo de avaliar os mecanismos de sinalização do sindecam-1 A estratégia escolhida para ajudar explicar essa questão será identificar os parceiros ligantes do sindecam-1 solúvel para avaliar a rede de interações do sindecam-1. Para isso, as células HaCaT (não tumorigênicas) e SCC-9 (tumorigênicas) serão marcadas metabolicamente por Stable-Isotope Labeling by Amino Acids (SILAC), transfectadas de forma transiente com o sindecam-1, e em seguida ativadas por (PMA). Os complexos de sindecam-1+ligantes solúveis no meio de cultivo serão imunoprecipitados e a identificação dos mesmos será realizada por proteômica quantitativa. Para validação da identidade desses complexos será realizado Western blot com anticorpo específico para cada ligante e experimentos de co-localização. Uma vez confirmados os parceiros do sindecam-1, alguns serão escolhidos para caracterização da interação por ensaio de fase sólida e cross-linking químico seguido por espectrometria de massas. Em seguida, o papel funcional dessa interação será estudado utilizando-se perda de função por iRNA do ligante de interesse em ensaios de migração e adesão. Espera-se que esse projeto possa contribuir para o conhecimento dos mecanismos de sinalização do sindecam-1 pelo o conhecimento de seus parceiros ligantes.