Estudo dos níveis de acetilação protéica em Trypanosoma cruzi

Resumo

Acetilação de resíduos de lisina tem emergido como uma das principais modificações pós-traducionais atuando em diferentes funções celulares em eucariotos superiores. Apesar das histonas serem os principais alvos de acetilação, é evidente que centenas de outras proteínas podem ser alvos de acetilação em diferentes compartimentos celulares. Durante o seu ciclo de vida, Trypanosoma cruzi é submetido a diferentes condições ambientais que requerem várias mudanças metabólicas para sua sobrevivência e que podem envolver mudanças nos níveis de acetilação proteica. Para investigar esse fenômeno nós avaliamos os níveis globais de acetilação proteica durante a mudança da forma não-infectiva para a forma infectiva (metaciclogênese) e diferenças aparentes foram observadas para diversas proteínas. Algumas alterações foram também detectadas durante a transição da forma exponencial para a forma estacionária, mas em um escala mais acentuada. Esses resultados preliminares sugerem um papel importante da acetilação proteica na regulação de mecanismos cruciais para T. cruzi. Os níveis de acetilação proteica são regulados através do balanço da atividade de duas famílias de enzimas, as lisina acetiltransferases (KATs) e as lisinas desacetilases (KDACs). Entre as KDACs nós encontramos as Sirtuínas, que são histona desacetilases NAD+-dependentes, envolvidas em diferentes mecanismos celulares, como silenciamento gênico, reparo de dano no DNA, envelhecimento e processos metabólicos. T. cruzi possui dois genes que codificam para sirtuínas, chamadas TcSir2rp1 e TcSir2rp3. Para investigar se essas proteínas poderiam participar no mecanismo de regulação dos níveis de acetilação proteica, nós geramos linhagens celulares superexpressando versões fusionadas com HA-tag de TcSir2rp1 e TcSir2rp3. Inicialmente, demonstramos que TcSir2rp1 esta presente no citoplasma celular, enquanto que TcSir2rp3 esta localizada na mitocôndria do parasita. Ambas linhagens possuem níveis menores de acetilação para determinadas proteínas quando comparadas com a linhagem selvagem, como demonstrado através de análises por imunoblotting com anticorpo para lisinas acetiladas. Quando avaliamos os efeitos da superexpressão dessas proteínas em processos fisiológicos do parasita, verificamos que elas possuem efeitos antagônicos. TcSir2rp3 é capaz de aumentar o crescimento e a diferenciação para a forma infectiva do parasita, quando comparada com a linhagem selvagem. Já TcSir2rp1causa um defeito tanto no creascimento como na diferenciação do parasita. Além disso, a superexpressão de TcSir2rp3 aumenta a resistência ao estresse oxidativo e diminui a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), quando comparada com a linhagem selvagem. Esses resultados sugerem que a acetilação proteica é relevante nos mecanismos de adapatação do parasita as mudanças ambientais e que as sirtuínas têm um papel fundamental nesse processo. Neste projeto, vamos analisar os níveis globais de acetilação proteica no parasita durante diferentes situações, para identificar as proteínas alvos da maquinaria de acetilação/desacetilação que podem estar envolvidas nos processos de diferenciação do parasita. Além disso, vamos investigar as proteinas-alvo das sirtuinas para melhor entender o papel delas na regulação dos processos metabólicos em T. cruzi. (AU)