Identificação dos requisitos mínimos para a sobrevivência de Leishmania em células hospedeiras: RNA-seq de fibroblastos L929 enucleados infectados por Leishmania amazonensis

Resumo

Células enucleadas, ou citoplastos (cujo núcleo é removido in vitro) são um modelo biológico sem paralelo e pouco explorado no estudo das infecções intracelulares. A enucleação celular, realizada por centrifugação na presença de citocalasina B antes dos ensaios de infecção, interrompe abrupta e completamente a transcrição de genes cromossômicos da célula hospedeira em resposta a patógenos intracelulares. Como resultado, importantes vias de sinalização núcleo-dependentes, como a via do NF-ºB por exemplo, tornam-se inoperantes. A enucleação não exclui, porém, que o patógeno possa afetar o destino dos mensageiros disponíveis, ou sua tradução em proteínas. Portanto, a ausência de transcrição de novo na célula anucleada, permite-nos identificar os transcritos que são alvos do parasita nas primeiras etapas da infecção. Este projeto de pesquisa visa identificar que transcritos remanescentes da célula hospedeira enucleada são preservados e garantem a sobrevivência e multiplicação do parasita intracelular Leishmania amazonensis. Assim estabeleceremos uma rede de interação mínima de proteínas preditas pelos transcritos requeridas para o parasitismo intracelular. Nossa estratégia de pesquisa envolve: i) a infecção de citoplastos, que permitem ao menos dois ciclos de divisão do parasita na ausência de transcrição de novo; ii) sequenciamento dos transcritos dos citoplastos e parasitas por RNA-seq, de modo a identificar quais transcritos do hospedeiro são preservados durante 48 horas de infecção intracelular nestas células sem núcleo; iii) comparar os perfis de transcritos de citoplastos infectados ou não com o parasita com o perfil da célula nucleada (fibroblastos linhagem L clone 929) infectada ou não. Os resultados obtidos, além de identificar os componentes do hospedeiro necessários e suficientes para a infecção intracelular, também podem elucidar se há algum controle, mediado pelo parasita, na manutenção e sobrevida de transcritos dos citoplastos. (AU)