Estudo do papel de LIMD2 na transição epitélio-mesênquima no câncer de tiroide

Resumo

A incidência do câncer de tiroide mais que triplicou nas últimas quatro décadas. Dentre os diferentes tipos histológicos do câncer de tiroide, o câncer diferenciado (CDT) representa 90% dos casos, sendo subclassificado em: câncer papilífero de tiroide (CPT) e câncer folicular de tiroide (CFT). Embora o CDT apresente um prognóstico favorável, cerca de 30% dos casos apresentam metástase aos linfonodos regionais e 2-13% dos pacientes apresentam metástases a distância, condição que reduz a taxa de sobrevivência dos pacientes. Desta forma, reconhecer marcadores moleculares associados ao processo de metástase pode auxiliar na identificação de marcadores de prognóstico. Neste sentido, nosso laboratório identificou a expressão do gene LIMD2 em linfonodos metastáticos, mas não em linfonodos normais, tampouco no tumor primário, sugerindo a participação deste gene na metástase. Desta forma, este estudo tem por objetivo avaliar a participação do gene LIMD2 na transição epitélio-mesênquima (TEM), processo no qual células epiteliais sofrem alterações genéticas, metabólicas e morfológicas reversíveis, levando a aquisição de um fenótipo mesenquimal, que confere capacidade invasiva e migratória. Para tanto, serão empregadas as linhagens celulares BCPAP portadoras da mutação BRAF V600E e TPC1, portadora da fusão RET/PTC1. A expressão de LIMD2 nas células BCPAP e TPC1 já foi confirmada em estudos prévios. A linhagem celular Nthy-ori 3-1 (derivada de tiroide normal) será empregada como controle. Usando a ferramenta CRISPR/Cas9, será realizado o knock-out do gene LIMD2 nas células BCPAP e TPC1. A avaliação da TEM será realizada por meio de análises metabólicas, incluindo a avalição do potencial de membrana mitocondrial e produção de espécies reativas de oxigênio por meio de imunofluorescência (IF) e citometria de fluxo (CF), empregando sondas comerciais. Os níveis de clastogenicidade serão avaliados pelo ensaio cometa. A aquisição do fenótipo-tronco será analisada por meio do teste de tumor-esfera, bem como pelos níveis de expressão de ALDH1 e Oct-3/4. Os níveis de expressão de diferentes marcadores da TEM, incluindo o switch de E- e N-caderina (proteínas epiteliais), STAT3, SLUG, TWIST (fatores de transcrição) e vimentina (marcador mesenquimal) serão avaliados por meio de IF, CF e Western blot. A morfologia celular será avaliada através de microscopia de contraste de fase, eletrônica de transmissão e varredura. A aquisição do fenótipo migratório será determinada por meio de vídeo time-lapse microscopy. A fim de confirmar a ação do gene LIMD2 in vivo, as células selvagens e geneticamente modificadas serão injetadas em camundongos nude. O crescimento neoplásico será monitorado com uso de paquímetro e PET-SCAN (avaliação de metástases) por 4-12 semanas. Os camundongos serão eutanasiados e os tumores primários, bem como as eventuais metástases serão cirurgicamente removidas. O material será incluído em parafina e destinado a: (1) análise histopatológica, (2) avaliação da composição de colágeno e (3) imunoistoquímica, sendo analisada a expressão das proteínas associadas a TEM.