Imunoterapia de nova geração - Direcionamento de linfócitos contendo receptores quiméricos para o combate ao câncer e bloqueio do checkpoint imunológico: eficácia terapêutica e estudos moleculares de mecanismos de exaustão de linfócitos.

Resumo

Linfócitos T (LT) contendo receptores quiméricos constituídos por domínios de ligação de anticorpos (do inglês: CAR, chimeric antigen receptor), capazes de serem diretamente ativados quando em contato com um antígeno específico, são uma nova geração de imunoterapia potente no combate ao câncer, ainda não explorada em pesquisa no Brasil. Resultados extraordinários vêm sendo obtidos no tratamento de tumores hematológicos com essa nova modalidade terapêutica, contudo, alguns desafios precisam ser superados para que a mesma seja eficiente contra tumores sólidos. Entre tais desafios, destaca-se a frequente indução de exaustão dos LT CAR pelo microambiente imunossupressor dos tumores. Este projeto tem como objetivo produzir LT CAR citotóxicos contra células malignas, capazes de bloquearem a exaustão do sistema imune. Tais LT CAR também serão utilizados como modelo de indução/reversão de exaustão para compreendermos a influência de componentes da matriz extracelular na indução da exaustão de linfócitos T, com foco no estudo dos glicosaminoglicanos (GAGs) - heteropolissacarídeos que participam de importantes processos celulares e que podem se comportar como co-receptores durante a estimulação de linfócitos T. A anidrase carbônica IX (CAIX) é um importante antígeno superexpresso em tumores sólidos em hipóxia, principalmente em carcinoma renal de células claras (ccRCC). Neste projeto, um vetor lentiviral bicistrônico de CAR anti-CAIX terá sua estrutura modificada por inserção de um domínio co-estimulatório 4-1BB. Tal domínio vêm demonstrando resultados superiores ao CD28 na manutenção prolongada de diversos tipos de LT CAR in vivo, apresentando menor indução de exaustão. Ainda, o segundo cassete de expressão deste vetor será clonado com o DNA codificante para um anticorpo anti-ligante de morte programada 1 (PD-L1) de alta afinidade. Este anticorpo tem capacidade de bloquear a exaustão dos LT, aperfeiçoando a resposta antitumoral dos LT CAR e de outros LT. Os LT serão transduzidos com os respectivos lentivirus e a eficiência da transdução será confirmada. Os efeitos dos LT CAR serão analisados in vitro em modelos de exaustão de LT e de citotoxicidade de diferentes linhagens de células de ccRCC. Os efeitos antitumorais dos LT CAR in vivo serão avaliados em modelo in vivo de ccRCC, por bioluminescência. Níveis de expressão Ki67 e PD-L1 serão utilizados para avaliação do efeito antitumoral dos LT CAR. A infiltração e a atividade dos LT no tumor serão analisadas por expressão de granzima B e CD3, por imunohistoquímica. Os LT serão ativados, expandidos e tratados com inibidores da síntese/sulfatação de GAGs ou serão incubados em co-cultura com células com ou sem GAG e submetidos à exaustão. Após estas incubações, os LT serão avaliados para marcadores de exaustão, secreção de citocinas e citotoxicidade. O perfil dos glicosaminoglicanos nos LT antes e após a indução de exaustão também será avaliado e verificaremos se o bloqueio do checkpoint imunológico pelo anticorpo anti-PD-L1 será capaz de alterar a produção dos GAGs pelos LT e pelas células tumorais, influenciando na malignidade do processo tumoral. Este projeto inovador possibilitará a produção de uma nova geração de imunoterapia de grande potencial antitumoral, além de contribuir para a compreensão de mecanismos de controle da exaustão de LT mediados por moléculas da matriz extracelular, permitindo aperfeiçoar o sistema imune como ferramenta no combate ao câncer. (AU)