Papel da osteoprotegerina na modulação in vitro de monócitos por células de papila apical

Resumo

Reabsorção de tecidos mineralizados é um evento biológico presente em patologias orais desafiadoras como doença periodontal, periodontite apical e reabsorção radicular externa. O papel de células mesenquimais na modulação do metabolismo ósseo já é conhecido, mas não o papel de células da papila apical neste contexto especialmente por meio do efeito de osteprotegerina (OPG). O objetivo deste estudo é investigar o papel de OPG produzida por células-tronco da papila apical (SCAP) na apoptose, migração e diferenciação de monócitos in vitro. Cultura primária de SCAP será estabelecida e as células serão submetidas ao silenciamento de OPG por transfecção lipossomal (SCAP-OPG KD ou SCAP-scr KD como controle negativo). O sobrenadante será coletado para validação do silenciamento por meio da quantificação de OPG além da detecção de outros fatores envolvidos com apoptose como TRAIL e interleucina (IL)-33 ou com migração celular como CCL2. Além disso, também será detectado o ligante de receptor de fator nuclear kappa B (RANKL). Com base nestes achados, serão preparados meios condicionados e estocados. Monócitos de sangue periférico serão isolados a partir de indivíduos saudáveis e colocados em cultura. Estas células serão tratadas com os meios condicionados de SCAP-OPG KD ou SCAP-scr KD e serão investigados quanto à viabilidade celular e apoptose na presença ou não de anticorpos neutralizadores de TRAIL e IL-33. Para migração celular, o meio condicionado será utilizado em conjunto com anticorpo neutralizante de CCL2. Por fim, os monócitos serão induzidos à diferenciação em osteoclastos com adição de M-CSF e RANKL na presença do meio condicionado de SCAP-OPG KD ou SCAP-scr KD por 21 dias. A avaliação da diferenciação em osteoclastos será feita por meio da análise de anéis de actina, detecção de fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) e catepsina K, atividade de TRAP e consumo de glicose e produção de lactato. SCAP serão imunomarcadas para RANKL nas membranas celulares e em seguida serão co-cultivadas com monócitos CD14+ por 14 dias. TRAP, catepsina K e RANKL serão avaliados por imunofluorescência bem como atividade de TRAP. Os dados serão analisados estatisticamente com base no padrão de normalidade de sua distribuição. Valores de p serão considerados significativos a 5%. (AU)