Glycosylation of L-asparaginase from E. coli through yeast expression and site-directed mutagenesis

Autor(es)

Lima, Guilherme Meira ^[1] ; Effer, Brian ^{[1, 2]} ; Biasoto, Henrique Pellin ^[1] ; Feijoli, Veronica ^[3] ; Pessoa, Adalberto ^[1] ; Palmisano, Giuseppe ^[3] ; Monteiro, Gisele ^[1]

Afiliação do(s) autor(es)

^[1] Univ Sao Paulo, Fac Ciencias Farmaceut, Dept Tecnol Bioquim Farmaceut, Sao Paulo - Brazil

^[2] Univ La Frontera, Fac Engn & Sci, Dept Chem Engn, Temuco - Chile

^[3] Univ Sao Paulo, Inst Biomed Sci, Dept Parasitol, Sao Paulo - Brazil

• Tipo de documento: Artigo Científico
• Fonte: Biochemical Engineering Journal; v. 156, APR 15 2020.
• Citações Web of Science: 0

Resumo

L-Asparaginase (L-ASNase) is a key component in the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL), but several clinical disadvantages, such as immunogenicity and rapid clearance, are still present. We evaluated the possibility to synthesize a new L-ASNase from Escherichia coll. with human-like glycosylation and study the glycosylation effect on the biochemical properties of the enzyme. Six L-ASNase mutants were also created in which L-ASNase glycosylation sites were removed through site-directed mutagenesis. The WT L-ASNase was successfully expressed, secreted and glycosylated by an engineered P. pastoris strain and presented predominantly Man 5 G1cNAc 2 glycans on its structure, which were then able to decrease L-ASNase immunogenicity in vitro. The purified glycosylated L-ASNase has shown a 30-fold decrease in specific enzymatic activity compared to the non-glycosylated proteoform, but a triple mutant L-ASNase (3M) was able to restore L-ASNase biological activity to significant levels. 3M accumulated in the yeast periplasmic space and there presented a 28fold increase in enzymatic activity when compared to the fully glycosylated proteoform. Both WT and 3M L-ASNases presented increased stability in human serum compared to non-glycosylated L-ASNase. This study demonstrates the important effects of glycosylation on L-ASNase properties and opens up new possibilities to use glycosylated L-ASNases for the treatment of ALL. (AU)

• Processo FAPESP: 15/07749-2 - Engenharia de proteínas e comparação de sistemas microbianos de expressão do biofármaco L-asparaginase
• Beneficiário: Gisele Monteiro
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Regular
• Processo FAPESP: 13/08617-7 - Produção de L-asparaginase extracelular: da bioprospecção à engenharia de um biofármaco antileucêmico
• Beneficiário: Adalberto Pessoa Junior
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Temático
• Processo FAPESP: 14/06863-3 - Modificações pós-traducionais para o diagnóstico de câncer e doenças parasitárias: abordagens metodológicas e implicações biológicas
• Beneficiário: Giuseppe Palmisano
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Jovens Pesquisadores
• Processo FAPESP: 18/18257-1 - EMU concedido no processo 14/06863-3: sistema de cromatografia líquida configurado para análise de carboidratos, aminoácidos, peptídeos e glicoproteínas
• Beneficiário: Giuseppe Palmisano
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Programa Equipamentos Multiusuários
• Processo FAPESP: 18/15549-1 - Modificações pós-traducionais nos processos biológicos e no diagnóstico da Doença de Chagas: novas abordagens metodológicas e implicações biológicas
• Beneficiário: Giuseppe Palmisano
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Jovens Pesquisadores - Fase 2
• Processo FAPESP: 16/15787-4 - Clonagem de L-asparaginase de Escherichia coli em linhagem de Pichia Pastoris com glicosilação humanizada
• Beneficiário: Guilherme Meira Lima
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica