Estudo do mescanismo de ação das vias de sinalização celular PI3K/AKt/mTOR e AMPK sobre a atividade da enzima glutaminase

Resumo

A proliferação celular comanda os processos de embriogênese e de crescimento do organismo, sendo essencial para a correta função de vários tecidos adultos. Apesar de ser importante para a homeostase do organismo, a sua desregulação compõe a força motriz do desenvolvimento tumoral. Somente nos últimos dez anos começou a ser evidenciada a relação entre as vias de tradução de sinais estimuladas por fatores de crescimento e a reorganização da atividade metabólica, a qual precisa priorizar a biossíntese e o aumento da biomassa, processos essenciais para a divisão celular. Em células tumorais, o consumo de glutamina é aumentando concomitante com o aumento da atividade de glutaminase nestas células. Três isoenzimas de glutaminase são expressas na maioria dos tecidos (liver-type glutaminase, kidney-type glutaminase e glutaminase C), todavia pouco se sabe sobre a necessidade específica de cada uma delas para o metabolismo tumoral. Vários artigos recentes têm definido o papel da glutaminólise, ou metabolismo da glutamina e seus subprodutos, na ativação da mTOR. Neste sentido é uma hipótese válida imaginar que mTOR possa contrarregular glutaminase. Resultados obtidos durante o mestrado da candidata mostraram que knockdown estável de PTEN em células MDA-MB 231 não afetou os níveis protéicos de GAC e KGA, assim como não houve mudança na localização subcelular das isoformas. Cinética enzimática da fração mitocondrial desta linhagem revelou que o knockdown de PTEN levou à uma diminuição do KM da enzima sem alteração de Vmax. De acordo, o tratamento com rapamicina, inibidor da mTOR, elevou o KM para os níveis detectados nas células controles. A atividade de glutaminase de lisado total de MDA-MB 231, NIH 3T3, IMR90 e BJ5TA foi afetada pelo tratamento com rapamicina conforme julgado por ensaios de dose e tempo resposta. Mais, ensaios de privação de glicose e glutamina nas mesmas linhagens demonstraram a inibição de mTOR e concomitante redução da atividade de glutaminase. Somado a isso o knockdown estável de TSC2 em MDA-MB 231 e BJ5TA promoveu superestimulação de mTOR e foi capaz de aumentar a atividade de glutaminase. A ativação de AMPK, um conhecido sensor de estresse energético, mostrou diminuir a atividade de glutaminase em célula de tumor de próstata, DU145. O primeiro objetivo deste projeto é o de definir o mecanismo de ação do complexo mTORC1 sobre a glutaminase. Em assunto relacionado, na comparação entre PC3 e DU145, verificamos que DU145 apresentou maior expressão de GAC e se mostrou mais responsiva à metformina, conhecido ativador de AMPK. O knockdown estável de AMPK em DU145, MDA-MB231 e NIH-3T3 levou a um aumento do nível protéico de KGA e diminuição de GAC, enquanto que em PC-3 nenhuma alteração foi vista. O segundo objetivo deste projeto é entender o mecanismo de regulação de glutaminase em nível protéico dirigido por AMPK.