Estudos biofísicos e bioquímicos de proteínas mitocondriais transmembrane e suas implicações para o processo de adaptação tumoral

Resumo

Esta proposta é dividida em duas partes principais, conforme determinado pelas proteínas de interesse: (1) cristalização e determinação da estrutura carreador mitocondrial de piruvato humano; (2) caracterização estrutural do complexo VDAC2-Bak da membrana externa mitocondrial humana por crio-microscopia eletrônica de partícula única. (1) O transporte ativo de piruvato glicolítico através da membrana mitocondrial interna (IMM) humana envolve duas subunidades carreadoras, MPC1 e MPC2, associadas em uma estrutura heterotípica oligomérica de 150 kDa. Nosso grupo demonstrou que a MPC2 humana homodimérica pode promover o transporte eficiente de piruvato em proteolipossomas reconstituídos in vitro. É importante notar que os requisitos funcionais derivados e as características cinéticas se assemelham aos já demonstrados para o transporte de piruvato em extratos mitocondriais. Nossos resultados estabelecem a estrutura inicial para explorar o papel independente da MPC2 na homeostase e doenças relacionadas à desregulação do metabolismo do piruvato. No entanto, para a desrição das base moleculares do transporte de piruvato, a determinação da estrutura atômica da MPC2 humana torna-se de grande importância. Neste contexto, propõe-se continuar a nossa colaboração bem sucedida com o Laboratório de Proteínas de Membranas (MPL), a fim de cristalizar MPC2 e coletar dados de difração de raios-X usando instalações de última geração e abordagens experimentais. A experiência adquirida trará benefícios na area de fronteira da biologia estrutural de proteínas de membrana.(2) Também conhecidas como porinas mitocondriais, VDACs (voltage-dependent anion-selective channel) são as proteínas integrais mais abundantes na membrana externa mitocondrial e considerada um novo alvo para medicamentos anti-cancer. Bak (Bcl-2-homologous antagonist/killer) pertence aos membros pro-apoptóticos da família de proteínas Bcl-2 e é constitutivamente integrada na membrana externa mitocondrial. Em células saudáveis, VDAC2 e Bak estão formam um complexo onde Bak aparece inativado ou reprimido. Os mecanismos de associação e dissociação do complexo VDAC2-Bak estão intimamente relacionados com a via apoptótica mitocondrial. Estudos demonstraram que a interferência neste complexo induz a morte celular programada em melanoma, um tipo de câncer com alta resistência às quimioterapias tradicionais e onde a deficiência homozigótica VDAC2 é letal para embriões de camundongo. Embora haja uma compreensão razoável do mecanismo regulatório de Bak, pouco se sabe sobre as funções do complexo VDAC2-Bak. Este projeto visa estabelecer bases para a investigação estrutural do complexo formado por VDAC2 e Bak e obter informações estruturais pelo método crio-microscopia eletrônica (Cryo-EM) por análise de partículas únicas. Para isso, as linhas celulares heterólogas serão estabelecidas para a produção de VDAC2 e Bak recombinantes, visando a subsequente purificação do complexo alvo. Após a purificação, as condições de investigação para o complexo por Cryo-EM serão inicialmente definidas pela técnica de coloração negativa (negative staining) e, em seguida, preparada em gelo amorfo). A obtenção de imagens do complexo puro permite o processamento pela técnica de Análise de Partículas Únicas. O modelo estrutural do complexo contribuirá na elucidação de como Bak interage estruturalmente com VDAC2, abrindo caminho para futuros estudos de utilização do complexo como alvo terapêutico. (AU)