Detecção dos grandes rearranjos gênicos na deficiência da 21-hidroxilase por uma nova metodologia, MLPA, e comparação com os resultados da técnica previamente estabelecida de Southern blotting

• Processo: 07/01761-4
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Regular
• Data de Início da vigência: 01 de agosto de 2007
• Data de Término da vigência: 31 de janeiro de 2009
• Área do conhecimento: Ciências da Saúde - Medicina - Clínica Médica
• Pesquisador responsável: Tania Aparecida Sartori Sanchez Bachega
• Beneficiário: Tania Aparecida Sartori Sanchez Bachega
• Instituição Sede: Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP (HCFMUSP). Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
• Assunto(s): Endocrinologia Esteroide 21-hidroxilase Rearranjo gênico Deleção de genes Mutação
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: deficiência da 21-hidroxilase | gene CYP21A2 | grandes rearranjos gênicos | hiperplasia adrenal congênita | Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification | Southern Blotting | Endocrinologia

Resumo

A deficiência da 21-hidroxilase (21OHD) é um frequente defeito do metabolismo, caracterizada por uma diversidade fenotípica, que varia desde virilização pré-natal da genitália externa no sexo feminino e pós-natal em ambos os sexos, podendo ainda coexistir uma grave deficiência de aldosterona, que se manifesta por desidratação hiponatrêmica no período neonatal. Estas várias formas clínicas resultam da presença de mutações no gene que codifica a enzima, CYP21A2, as quais causam diferentes comprometimentos da atividade enzimática. Devido à presença de um pseudogene altamente semelhante, em cadeia, a principal origem de mutações na 21OHD é decorrente de eventos de recombinação gênica entre o gene ativo e o pseudogene. Estas mutações podem ser deleções do CYP21A2, grandes conversões gênicas ou mutações de ponto. Existem também deleções ou duplicações do pseudogene, as quais não alteram a atividade da enzima, mas podem dificultar a análise do número de cópias da unidade CYP21. A 21OHD apresenta a sua biologia molecular amplamente estudada e o seu diagnóstico molecular tem sido utilizado em várias situações na prática clínica. Para a pesquisa das mutações de ponto foram padronizados métodos de screening que permitem a sua utilização em larga escala, assim como o estudo de grande número de pacientes ao mesmo tempo, citando-se o PCR alelo-específico. Para a pesquisa dos rearranjos gênicos, a metodologia mais utilizada é a do Southern blotting seguida de hibridação in situ com sonda específica. Entretanto, esta técnica apresenta os inconvenientes de exigir grande quantidade de DNA; são necessárias várias etapas em sua execução, o que aumenta o tempo de obtenção dos resultados (±7 dias) e pode gerar a possibilidade de erros e o método de marcação em geral utiliza material radioativo. Estes inconvenientes não estão presentes com a metodologia de Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA), a qual utiliza pequenas quantidades de DNA, dispensa o uso de radioativo e trata-se de um procedimento relativamente rápido, sendo possível obter os resultados em dois dias. Porém, não há na literatura validação deste método para a detecção dos grandes rearranjos na 21OHD e não é sabido se discriminaria os diferentes tipos de rearranjos gênicos, os quais podem estar presentes em um mesmo paciente. Objetivos: comparar a sensibilidade e a especificidade da metodologia MLP para a detecção dos rearranjos gênicos na unidade CYP21, através de análise comparativa com os resultados da técnica de Southern blotting, previamente padronizada em nosso laboratório. Casuística e Metodologia: serão estudados DNA de 150 pacientes portadores de 21OHD quanto ao número de copias e tipos de rearranjos presentes no locus CYP21 com a técnica de MLPA. Todos os pacientes tiveram seu DNA avaliado anteriormente pela metodologia de Southern blotting seguida de hibridação in situ com sonda do gene da 21-hidroxilase. Neste estudo será utilizado o kit SALSA MLPA kit P050B CAH (MRC-Holland, Amsterdam, The Neatherlands) que contém oito conjuntos de sondas específicas para os genes CYP21A2 e CYP21A1P e as reações serão realizadas de acordo com o protocolo do fabricante. (AU)