Investigação da relação entre estrutura e função em fosfolipase lisina 49

• Processo: 96/11165-3
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Jovens Pesquisadores
• Data de Início da vigência: 01 de setembro de 1997
• Data de Término da vigência: 31 de agosto de 2001
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Biofísica - Biofísica Molecular
• Pesquisador responsável: Richard John Ward
• Beneficiário: Richard John Ward
• Instituição Sede: Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto (FFCLRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
• Auxílio(s) vinculado(s): 00/04763-9 - Mutagenesis in the active site region of bothropstoxin-I, lys49-phospholipase A2 homologue, AR.EXT
• Bolsa(s) vinculada(s): 01/06388-3 - Expressão em E. coli e purificação de mutantes de bothropstoxina-I do veneno de B. jararacussu e mapeamento de superfície através de mutagênese sítio dirigida de triptofanos, BP.IC; 01/04812-2 - Mapeamento do sítio miotóxico de Bothropstoxina-I, uma PLA2-Lys49 do veneno de Bothrops jararacussu, através de mutagênese sítio-dirigida, BP.IC; 00/03517-4 - Investigação da relação entre estrutura e função em fosfolipses A2 lisina-49 (Lys49-PLA2), BP.TT; + mais bolsas vinculadas 98/14568-7 - Função da região C-terminal na atividade de bothropstoxina-I, uma fosfolipase lys-49 do veneno de Bothrops jararacussu, BP.MS; 98/14569-3 - Mutagênese sítio-dirigida na região de ligação do substrato lipídico de bothopstoxina-I de Bothrops jararacussu, BP.MS; 98/14686-0 - Avaliação da estabilidade da forma dimérica na atividade danificadora de membranas Ca+2 independente de bothropstoxina-I da serpente Bothrops jararacussu, BP.MS; 97/14370-0 - Investigacao da interacao entre a fosfolipase a2 lisina 49 (pla2-lis49) de bothrops jararacussu e membranas artificiais., BP.MS; 97/02852-0 - Investigação da relação entre estrutura e função em fosfolipase lisina 49, BP.JP - menos bolsas vinculadas
• Assunto(s): Fosfolipases Mutagênese
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Espectrofluorescencia | Fosfolipase | Mutagenese Sitio Ditigido | Relacao Estrutura Funcao
• Publicação FAPESP: https://media.fapesp.br/bv/uploads/pdfs/Investindo...pesquisadores_68_90_91.pdf

Resumo

As fosfolipases A2 (PLA2) catalisam a hidrólise de pontes ácido-éster na posição sn-2 dos fosfolipídeos, liberando ácidos graxos e lisofosfolipídeos. Esses produtos de hidrólise servem como substratos para a produção de ácido aracadônico e têm um padrão na regulação da resposta inflamatória e agregação de plaquetas. Tais funções regulatórias fazem com que as PLA2 sejam um alvo em potencial para a intervenção química no tratamento de doenças como artrite. Nesse sentido, o entendimento das interações proteína/lipídeo é essencial para o desenvolvimento de novos medicamentos. As PLA2 apresentam um alto grau de homologia, no nível de sequência de aminoácidos, e as comparações das diferentes sequências de aminoácidos revelaram que os resíduos envolvidos no sítio ativo são conservados. O resíduo Asp49 mostrou estar envolvido na ligação de cálcio, o que serve como um cofator na catálise e, na ausência deste íon, as PLA2s são inativas. Varias PLA2 foram isoladas a partir de venenos de serpentes Bothrops que perderam ou apresentam atividade catalítica extremamente baixa, e as sequências de aminoácidos dessas PLA2s revelaram que o Asp49 está substituído por uma lisina. A consequência dessa substituição é a perda da capacidade de ligação do cofator Ca2+, o que leva à ausência de atividade catalítica. Apesar de não apresentar atividade enzimática, a interação da PLA2-Lys49 com lipossomos de composição lipídica variada provoca uma liberação rápida do conteúdo aquoso dos lipossomos. Este processo é independente de íons cálcio e ocorre sem hidrólise fosfolipídica detectáve1. Utilizando a BthTxI de Bothrops jararacussu como um sistema-modelo, pretendemos investigar as bases estruturais do mecanismo que resulta em dano à membrana por PLA2-Lys49, combinando técnicas de biologia molecular e espetrofluorimetria. O sistema de expressão de BthTxI em E. coli, bem como o protocolo de purificação da proteína recombinante encontram-se estabelecidos. No presente projeto, pretendemos empregar mutagênese sítio-dirigida para gerar mutações pontuais na BthTxI. Após a obtenção de proteínas mutantes purificadas, os efeitos causados pelas mudanças na estrutura e na função da proteína serão avaliados utilizando-se diferentes técnicas de fluorescência. Bicamadas lipídicas artificiais foram muito usadas em estudos de interações entre proteínas e membranas. Lipossomas apresentam um modelo de membrana com as vantagens da simplicidade de preparação, facilidade para variar a composição de membrana e flexibilidade em termos de uso. Historicamente, o estudo das interações de PLA2 com lipídios empregou bicamadas lipídicas não hidrolisáveis e inibidores de catálise. As PLA2-Lys49 oferecem a possibilidade de estudar a interação da PLA2 com lipídeos naturais, sem os problemas associados com hidrólise e esgotamento das bicamadas. (AU)

Publicações científicas

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(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)

CHIOATO‚ L.; DE OLIVEIRA‚ A.H.C.; RULLER‚ R.; SÁ‚ J.M.; WARD‚ R.J.. Distinct sites for myotoxic and membrane-damaging activities in the C-terminal region of a Lys49-phospholipase A2.. Biochemical Journal, v. 366, n. Pt 3, p. 971, 2002. (96/11165-3, 98/14686-0, 98/14569-3, 98/14568-7, 97/14370-0)

SÁ‚ J.M.; CHIOATO‚ L.; FERREIRA‚ T.L.; DE OLIVEIRA‚ A.H.C.; RULLER‚ R.; ROSA‚ J.C.; GREENE‚ L.J.; WARD‚ R.J.. Topology of the substrate-binding site of a Lys49-phospholipase A2 influences Ca2+-independent membrane-damaging activity. Biochemical Journal, v. 382, n. Pt 1, p. 191, 2004. (96/11165-3, 00/11165-0, 98/14686-0, 01/06388-3, 98/14569-3)

WARD‚ R.J.; CHIOATO‚ L.; DE OLIVEIRA‚ A.H.C.; RULLER‚ R.; SÁ‚ J.M.. Active-site mutagenesis of a Lys49-phospholipase A2: biological and membrane-disrupting activities in the absence of catalysis.. Biochemical Journal, v. 362, n. Pt 1, p. 89, 2002. (96/11165-3, 98/14686-0, 98/14569-3, 98/14568-7, 97/14370-0)

RULLER‚ R.; ARAGAO‚ EA; CHIOATO‚ L.; FERREIRA‚ T.L.; DE OLIVEIRA‚ AHC; SA‚ JM; WARD‚ RJ. A predominant role for hydrogen bonding in the stability of the homodimer of bothropstoxin-I‚ A lysine 49-phospholipase A₂. Biochimie, v. 87, n. 11, p. 993-1003, 2005. (96/11165-3, 00/11165-0, 98/14686-0, 01/06388-3, 98/14569-3)