Papel da o-gluconacilação na atividade do fator de transcrição foxo1: fisiologia da célula endotelial vascular na hiperglicemia

• Processo: 21/04378-4
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de maio de 2021
• Data de Término da vigência: 31 de outubro de 2022
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Farmacologia - Farmacologia Cardiorenal
• Pesquisador responsável: Rita de Cassia Aleixo Tostes Passaglia
• Beneficiário: Carina Amarante Pedersoli
• Instituição Sede: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 13/08216-2 - CPDI - Centro de Pesquisa em Doenças Inflamatórias, AP.CEPID
• Assunto(s): Disfunção endotelial Hiperglicemia O-GlcNAcilação
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Célula endotelial vascular | disfunçao endotelial | Disturbio metabólico | Foxo1 | Hiperglicemia | O-GlcNAcilação | Metabolismo celular endotelial

Resumo

O aumento crônico do conteúdo de proteínas intracelulares O-GlucoNAciladas (O-GlcNAc) é uma das alterações promovidas pelo diabetes mellitus(DM). O DM é um dos principais fatores de risco para a hipertensão arterial, aterosclerose, acidente vascular cerebral, doença arterial coronariana e insuficiência cardíaca, sendo estas as grandes responsáveis pela alta taxa de morbidade e mortalidade dos portadores desse distúrbio metabólico. O estado hiperglicêmico modula negativamente vários fatores regulatórios da atividade de células endoteliais vasculares, gerando disfunção na sua capacidade de responder a estímulos humorais e mecânicos. As alterações produzidas pela hiperglicemia na liberação de fatores dilatadores e constritores pelas células endoteliais comprometem o ajuste fino do tônus vascular, com consequente aumento na resistência vascular periférica, contribuindo para lesões em órgãos como os rins, coração, olhos e cérebro. Além disso, altera o metabolismo da célula endotelial, de forma a deslocar a glicose para outras vias, como a via da biossíntese de hexosaminas (VBH). A hiperglicemia, ao gerar excessiva ativação desta via, causa aumento crônico do conteúdo de proteínas O-GlucoNAciladas, resultando em alterações na atividade, localização e reciclagem deimportantes proteínas, como a sintase endotelial de óxido nítrico (eNOS). Dados anteriores do laboratório mostram que a eNOS modificada por O-GlcNAc tem sua função de produzir óxido nítrico (NO) comprometida, configurando-se como um sinal de disfunção endotelial. Além disso, a modificação por O-GlcNAc aumenta a expressão, translocação e atividade do fator de transcrição FoxO1. O FoxO1 ativa genes associados tanto a respostas de resistência ao estresse oxidativo como à disfunção da célula endotelial. Sendo assim, o objetivo deste trabalho é usar células endoteliais de linhagem humana e submetê-las a estresse por alta concentração de glicose para investigar a hipótese de que o aumento de proteínas modificadas por O-GlcNAc modifica a atividade do FoxO1, aumentando o estresse oxidativo e reduzindo a biodisponibilidade de NO no endotélio vascular. Inicialmente, a taxa de proteínas modificadas por O-GlcNAc e a presença de FoxO1 no citosol e no núcleo será determinada por western blot. Um bloco adicional de experimentos será realizado aumentando ou impedindo a modificação por O-GlcNAc usando thiamet G e L-DON, inibidores da OGA e GFAT, respectivamente. A formação de espécies oxidantes será medida usando a sonda fluorescente DCFDA. Para investigar a O-GlucoNAcilação direta do FoxO1, células HEK293T serão enriquecidas com o plasmídeo que codifica este fator de transcrição e, após o estímulo com thiamet G, será realizada imunoprecipitação do complexo FoxO1-O-GlcNAc. Para testar esta hipótese em um modelo animal, serão montadas preparações de artérias isoladas de animais espontaneamente hiperglicêmicos, camundongos db/db, para medir o relaxamento promovido por acetilcolina. Estes animais também serão tratados com AS 1842856, inibidor da atividade do FoxO1, para se investigar a recuperação do relaxamento dependente de endotélio.