Aplicação do método baseado em CRISPR/Cas9-riboswitch para regular negativamente a expressão da quinase inositol polifosfato (IP6K) em Trypanosoma cruzi

• Processo: 22/04595-8
• Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Mestrado
• Data de Início da vigência: 12 de agosto de 2022
• Data de Término da vigência: 11 de fevereiro de 2023
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Parasitologia - Protozoologia de Parasitos
• Pesquisador responsável: Marcelo Santos da Silva
• Beneficiário: Bryan Etindi Abuchery
• Supervisor: Noelia Marina Lander Manfredi
• Instituição Sede: Instituto de Biociências (IBB). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Botucatu. Botucatu , SP, Brasil
• Instituição Anfitriã: University of Cincinnati, Estados Unidos
• Vinculado à bolsa: 20/16480-5 - Geração de linhagens de T. cruzi (cepa CL Brener) nocautes (KO) para IP6K e avaliação da capacidade de reparo por recombinação homóloga (HR), BP.MS
• Assunto(s): Biologia molecular Doença de Chagas Repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas CRISPR-Cas9 Trypanosoma
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Cas9-riboswitch-based method | Chagas Disease | Crispr | dormancy | drug target | inositol pyrophosphates | Trypanosoma | Biologia Molecular de tripanosomatídeos

Resumo

Os pirofosfatos de inositol (PP-IPs) - principalmente IP7 e IP8 - estão envolvidos em uma ampla gama de processos celulares em eucariotos. No entanto, o mecanismo de ação dos PP-IPs não é totalmente compreendido. IP7 e IP8 são sintetizados por vias que envolvem a participação das quinases IP6K e PP-IP5K, respectivamente. Os tripanossomatídeos possuem gene ortólogo para IP6K, mas aparentemente não possuem ortólogos para PP-IP5K, ou seja, provavelmente não sintetizam IP8, o que os torna excelentes modelos para o estudo de IP7. Usando o sistema CRISPR/Cas9 e duas rodadas de transfecção, deletamos com sucesso um alelo de IP6K em Trypanosoma cruzi (agente etiológico da doença de Chagas), gerando uma linhagem single-null (IP6K-/+). Também conseguimos gerar uma linhagem double-null (IP6K-/-). No entanto, não conseguimos selecionar clones desta linhagem por ela não ser capaz de proliferar, ou seja, a maioria das células IP6K-/- morreram alguns dias após a transfecção, deixando dúvida sobre a essencialidade da IP6K neste organismo. Contudo, a remoção de um único alelo de IP6K causou vários efeitos morfológicos, como arredondamento e enrugamento do corpo celular, aumento do número de glicossomos e aumento mitocondrial. Além disso, a linhagem IP6K-/+ apresentou uma leve parada do ciclo celular na fase G0/G1, mas nenhum dano ao DNA foi detectado. Então, desenvolvemos um ensaio pioneiro para quantificar células quiescentes (dormentes) e descobrimos que a depleção parcial de IP6K leva parte da população de T. cruzi à dormência. No entanto, ainda não sabemos se IP6K é um gene essencial e se os efeitos observados na linhagem IP6K-/- foram de fato devido à ausência de IP6K. Assim, pretendemos aplicar o método CRISPR/Cas9-riboswitch-based em T. cruzi (CL Brener) em colaboração com a Dra. Noelia Lander para regular negativamente a expressão de IP6K. Essa abordagem consiste em marcar IP6K com a ribozima ativa (glmS) ou inativa (M9) e, em seguida, induzir seu silenciamento com glucosamina. A seguir, avaliaremos a taxa de crescimento, duração das fases do ciclo celular, porcentagem de células quiescentes, características morfológicas e possíveis alterações metabólicas na linhagem gerada. Essa abordagem beneficiará ambos os grupos, pois permitirá expandir sua aplicabilidade a outros tripanossomatídeos. Além disso, os resultados esperados esclarecerão os efeitos da perda de IP6K no patógeno humano T. cruzi, o que contribuirá significativamente para um melhor entendimento da pirofosforilação realizada por IP7, uma modificação pós-traducional não enzimática ainda pouco compreendida. (AU)