Estudo da formação de domínios em membranas modelos induzidos por peptídeos antimicrobianos e sua ação interfacial

Autor(es)

Dayane dos Santos Alvares

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: São José do Rio Preto. 2016-06-15.
• Instituição: Universidade Estadual Paulista (Unesp). Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas. São José do Rio Preto
• Data de defesa: 2016-05-13
• Orientador: João Ruggiero Neto

Resumo

Peptídeos antimicrobianos agem diretamente na matriz lipídica da membrana celular perturbando o empacotamento lipídico, criando tensões elásticas e desequilíbrio de massa, que são relaxados pela formação de poros ou defeitos que dão origem ao processo lítico. Polybia-MP1, ou simplesmente MP1, com sequência de aminoácidos IDWKKLLDAAKQIL-NH2, extraído da vespa nativa Polybia paulista, é um exemplo destes peptídeos. Além de potente atividade antimicrobiana ele inibe a proliferação celular em culturas de células de câncer de próstata e bexiga. Este efeito inibitório acredita-se ser devido à presença simultânea de aminofosfolipídios fosfatidilserina (PS) e fosfatidiletanolamina (PE) nas monocamadas externas das membranas destas células. Investigação da atividade lítica em vesículas unilamelares gigantes (GUVs) revelaram que o peptídeo induziu a formação de regiões fluorescentes densas que foram atribuídas à agregação peptídeo/lipídio ou então à segregação lipídica. A atividade permeabilizadora do MP1 foi também fortemente modulada quando as GUVs continham frações de aminofosfolipídios PS e PE. Foi observado que a permeabilidade induzida pelo MP1 aumentou dramaticamente para vesículas de PC/PE/PS (7:1:2) permitindo influxo de moléculas de 10 kDa. Esta tese investigou a habilidade do MP1 em perturbar o empacotamento lipídico usando monocamadas lipídicas como modelo de membrana. Foram utilizados três fosfolipídios: PC, PE e PS contendo duas cadeias acíclicas. Isotermas de compressão foram obtidas usando cuba de Langmuir conjugadas com microscópios de fluorescência e de ângulo de Brewster. Por meio de isotermas de compressão de filme lipídico foram investigadas a preferência do peptídeo pelas fases lipídicas e seu efeito na coexistência de fases e nas alterações induzidas na forma, tamanho e número de domínios sólidos. Utilizando cadeias acíclicas derivadas de ácidos mirístico e palmítico ligados às cabeças polares PC, PE e PS, foi possível explorar o papel das cabeças polares e o efeito do comprimento das caudas no impacto do peptídeo nos filmes lipídicos. Estes experimentos mostraram que MP1 induziu mudanças na forma e no tamanho dos domínios sólidos. Estas alterações foram dependentes das cabeça polar e das condições da subfase: água pura e solução aquosa de NaCl. É importante destacar que em condições de subfase nas quais pares iônicos intermoleculares entre os aspárticos e lisinas podem ocorrer, em água e em baixa concentração de sal, o peptídeo co-cristalizou com lipídios de DPPC induzindo significativa mudança na forma de “triskelion” para formas alongadas e no tamanho dos domínios sólidos. Mudanças na forma e no tamanho foram também observados para DMPE e DMPS, mas com mecanismos diferentes. Devido a grande preferência de MP1 por filmes de PS foi observado que parte do filme peptídeo/lipídio foi expelido para a subfase em valores de pressão lateral compatíveis com a de bicamadas, sugerindo micelização do filme lipídico. Estas evidências de mudanças no empacotamento lipídico induzidas pelo peptídeo foram reforçadas investigando o efeito do MP1 no influxo de carboxifluoresceína em GUVs de PC/PS e PC/SM/Chol contendo ou não PS. Nesta última composição, domínios líquido-ordenados (Lo) podem ser visualizados e na presença de PS foi observado a formação de regiões densas na região líquido-desordenado (Ld) na membrana. Na presença de PS o MP1 induziu poros ou defeitos que permaneceram abertos na escala de tempo de minutos. Evidências para segregação lipídicas foram obtidas por experimentos de calorimetria diferencial de varredura (DSC) usando vesículas de DPPS puro e de misturas POPC/DPPS. Os resultados obtidos mostraram a indução de uma fase rica de peptídeo e lipídios aniônico e outra rica de lipídio zwitteriônico e perturbação no empacotamento lipídico de vesículas de lipídio aniônico puro. (AU)

• Processo FAPESP: 12/08147-8 - Estudo da formação de domínios em membranas modelo induzidos por peptídeos antimicrobianos e sua ação interfacial
• Beneficiário: Dayane dos Santos Alvares
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado