Estabelecimento de um modelo de epiderme em 3D proveniente de células imortalizadas a ser utilizado como plataforma de avaliação da toxicidade dérmica induzida por corantes de tinturas capilares

Autor(es)

Camila Alessandra Mini

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Ribeirão Preto.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (PCARP/BC)
• Data de defesa: 2020-08-12

Membros da banca

Danielle Palma de Oliveira; Lusania Maria Greggi Antunes; Lorena Rigo Gaspar Cordeiro; Daniela Morais Leme

• Orientador: Danielle Palma de Oliveira; Silvya Stuchi Maria Engler

Resumo

Com a adoção de métodos alternativos ao uso de animais na comunidade científica, diversos grupos trabalharam para o desenvolvimento de novos modelos capazes de ser aplicados na avaliação da toxicidade de substâncias/produtos. Tratando-se de exposição dérmica, os modelos de pele/epiderme reconstruída foram desenvolvidos no mundo todo, porém a aquisição desses modelos no Brasil é bastante dificultosa. Devido a isso, o objetivo aqui proposto foi o desenvolvimento de um modelo tridimensional de epiderme, utilizando queratinócitos imortalizados (HaCaT-EHE) para aplicação na avaliação de toxicidade de corantes presentes em tinturas capilares, além da comparação dos efeitos com a cultura celular em monocamada. Após a construção do modelo tridimensional, foi avaliada a diferenciação celular por métodos histológicos/imunohistoquímicos, validação do método analítico de determinação do sal de formazan utilizado nos testes de corrosão e irritação. Foi verificada a permeabilidade da membrana e proficiência do modelo em diferenciar substâncias irritantes, não irritantes, corrosivas e não corrosivas. Para avaliação de endpoints de toxicidade foram realizados ensaio de genotoxicidade (ensaio do Cometa), viabilidade/citotoxicidade (MTT, teste de viabilidade celular por anexina V/PI e teste de Tunel) e irritação e corrosão. O modelo apresentou diferenciação celular e expressão dos biomarcadores de desenvolvimento das camadas, além disso apresentou permeabilidade de membrana semelhante aos modelos já validados. O método para a determinação do sal de formazan mostrou ser seletivo, exato, preciso e robusto. Além disso, apresentou um índice de recuperação superior a 85% e variação inferior a 15%, e não foi observada a presença resíduos do sal após uma injeção com concentração elevada. Adicionalmente, o modelo demonstrou boa predição para irritação (seletividade 100%, especificidade 75% e exatidão 90%) e também para corrosão (seletividade 100%, especificidade 100% e exatidão 100%) para as substâncias testadas. Quanto aos corantes, o Basic Blue 99 (BB99) não demonstrou efeitos genotóxicos em ambos modelos, porém, demonstrou queda na viabilidade celular, além de intensa marcação com PI e dupla marcação (anexina e PI) indicando morte celular por necrose no modelo 2D. No modelo 3D, observou-se intensa marcação com fluoresceína em todas as concentrações testadas, indicando ocorrência apoptose. Como esperado, o BB99 se mostrou irritante após a exposição por 30 minutos, embora não tenha induzido a efeito corrosivo. Já o corante Basic Red 51 (BR51) induziu a efeitos genotóxicos em ambos os modelos, além disso provocou queda na viabilidade celular no modelo 2D e no modelo 3D induziu a marcação com a fluoresceína. O corante não apresentou efeitos irritantes e corrosivos. Frente ao exposto, podemos concluir que o modelo apresentou boa predição e pode ser utilizado como plataforma de estudos de avaliação da segurança/toxicidade de produtos após a exposição dérmica. Os corantes testados demonstraram efeitos tóxicos em concentrações inferiores ao limite recomendado pelo Comitê Científico Europeu e, desta forma, a utilização em produtos comerciais de tinturas capilares deveria ser revista. (AU)

• Processo FAPESP: 16/15660-4 - Avaliação de efeitos tóxicos locais na epiderme decorrentes da exposição a corantes utilizados em tinturas capilares
• Beneficiário: Camila Alessandra Mini
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto