Caracterização funcional e estrutural de uma metaloprotease não-hemorrágica com atividades antitumoral e microbicida isolada do veneno de Bothrops pirajai

Resumo

As metaloproteases de venenos de serpentes compreendem um grupo de enzimas dependentes de zinco de massa molecular variável (classificadas de PI a PIV), que são responsáveis pelo efeito hemorrágico induzido pelas serpentes Viperinae e Crotalinae. Este projeto propõe a caracterização bioquímica, molecular e estrutural de uma metaloprotease de baixo peso molecular (classe PI) do veneno de Bothrops pirajai, assim como a sua caracterização funcional (atividades enzimáticas, tóxicas e farmacológicas). Esta protease será isolada por cromatografia de troca iônica seguida por interação hidrofóbica, e após a verificação de seu grau de pureza por SDS-PAGE e HPLC, será utilizada para caracterização bioquímica (pI, peso molecular, conteúdo de íons divalentes, e composição em aminoácidos) e funcional. A sequência completa da metaloprotease será determinada pelo sequenciamento direto da proteína, permitindo uma abordagem estrutural mais elaborada através de estudos de modelagem molecular e cristalografia de raio x. As atividades enzimáticas serão avaliadas sobre diferentes substratos (caseína, fibrina, fibrinogênio e colágeno), com variações de concentrações de enzima, pH, temperatura, íons divalentes, agentes quelantes e tempo de incubação. Esta protease também será testada quanto aos efeitos tóxicos (miotoxicidade sobre os músculos gastrocnemius direito, citotoxicidade sobre células endoteliais e tumorais, hemorragia, e letalidade) e farmacológicos (coagulante, anticoagulante, efeito sobre plaquetas, atividades microbicida, antitumoral e indução de edema). Os estudos serão complementados com ensaios imunoquímicos, abrangendo produção e purificação de anticorpos policlonais, testes de imunorreatividade cruzada e neutralização de atividades tóxicas e farmacológicas. Os aspectos abordados neste trabalho poderão trazer informações complementares sobre os mecanismos de ação, relacionando estrutura e função, podendo resultar no melhor entendimento dos efeitos induzidos pelas metaloproteases de venenos de serpentes e da participação, direta ou sinérgica, desta proteína no envenenamento causado pela serpente Bothrops pirajai. (AU)