Investigação bioquímica da função da enzima PRMT7 na infectividade de parasitos Leishmania spp: varredura de alvos de relevância para Leishmaniose

Resumo

As Leishmanioses são a nona doença infecciosa em número de casos e a segunda maior em mortes, pondo em risco dez por cento da população mundial. A OMS estima 0,7-1,2 milhões de novos casos de leishmaniose cutânea anualmente enquanto a Leishmaniose visceral infecta 200.000-400.000, levando 10-20% a óbito. O Brasil é afetado por todas as patologias desta doença com 30.000 novas infecções por ano. Não existem vacinas e há um aumento na resistência a tratamentos disponíveis; que são caros, altamente tóxicos e inviáveis para crianças. Apesar da necessidade urgente para intervenção, a leishmaniose permanece uma doença negligenciada. Parasitas de Leishmania spp. se adaptam a mudanças drásticas no ambiente durante a transmissão entre vetores de insetos e hospedeiros humanos. Adaptações específicas no ciclo de vida permitem a transmissão do parasito entre hospedeiros e perpetuam as infecções e doenças. Reguladores moleculares que coordenam o fitness desses parasitos para diferentes hospedeiros e promovem a infecção pelo parasito são críticos para um maior entendimento dessa doença. Em uma recente colaboração, os laboratórios de Angela Cruz e Pegine Walrad iniciaram a investigação do papel de um relevante regulador molecular em Leishmania major, a arginina metiltransferase PRMT7, que resultou na publicação no periódico científico Molecular Microbiology. A enzima PRMT7 do parasito é diferencialmente expressa durante o desenvolvimento de L. major e é um novo regulador da virulência do parasito. Nós propomos combinar o conhecimento e experiência dos dois grupos e instalações para caracterizar bioquimicamente a função de PRMT7 e explorar como esta e suas proteínas alvo regulam a virulência do parasito. PRMT7 é a primeira enzima metilase a ser implicada em interação parasita-hospedeiro. Evidências preliminares sugerem que ela deve agir via modificação de proteínas ligantes de RNA, RBPs. Nós iniciaremos esse estudo realizando o crosslinking de células de Leishmania e a imunoprecipitação de proteínas associadas. Nós iremos identificar alvos candidatos utilizando tecnologias de ponta de iTRAQ LC-MS e fracionamento 2D sem uso de gel no Centro de Excelência em Espectrometria de Massas da Universidade de York. Esta estratégia é até 50 vezes mais sensível do que métodos usuais. Iremos comparar os resultados com aqueles obtidos anteriormente. Além disso, nós conduziremos ensaios de metilação in vitro utilizando [3H]AdoMet, PRMT7 recombinante e possíveis substratos acoplados a cromatografia catiônica de alta resolução para verificar a formação de monometil arginina por PRMT7. Nós iremos isolar transcritos associados a duas RBPs selecionadas alvos de PRMT7 e testar se as interações destas com RNAs encontram-se alteradas nos parasitos nocaute para PRMT7. RNAs associados serão identificados via Hi-Seq no Centro de Pesquisa Genômica do MRC (Reino Unido). Nós iremos examinar e discutir as implicações dos dados obtidos nesse trabalho para direcionar e inspirar a nossa aplicação para o programa de auxílio BBSRC-FAPESP. Compreender a função e atividade da enzima PRMT7 implicada na infectividade irá gerar conhecimento importante para propor maneiras de combate à Leishmaniose. (AU)