Avaliação semi-quantitativa do conteúdo lipídico de oócitos bovino maturados in vitro sob efeito da via GMPc

Resumo

Oócitos e blastocistos de bovinos produzidos in vitro apresentam citoplasma mais escuro como consequência de acúmulo de lipídios mais elevado em relação aos embriões produzidos in vivo. Tal característica tem sido associada com a qualidade inferior do embrião produzido in vitro e, por consequência, sua elevada sensibilidade à criopreservação. Maior conhecimento sobre o controle do metabolismo lipídico em oócitos poderá ocasionar modificações na própria célula oocitária, para torná-la capaz de originar embriões mais criopreserváveis, contribuindo para a disseminação da técnica de produção in vitro (PIV). Em adipócitos de humanos, além da via clássica mediada pelo AMPc sobre a lipólise celular, foi observado que a via GMPc, através da proteína cinase dependente de GMPc (PKG), ativa enzimas importantes no processo. Portanto, níveis intracelulares de ambos os nucleotídeos estão envolvidos na regulação da taxa de lipólise. Como uma série de enzimas de síntese e degradação do GMPc já foi detectada no complexo cumulus oócitos (CCOs) de bovino, é possível que a manipulação dessa via sinalizadora durante a maturação possa exercer influência sobre o metabolismo lipídico de oócitos da mesma maneira que exercem em adipócitos. O objetivo desse trabalho é intervir na via GMPc por diferentes estímulos, buscando o aumento desse nucleotídeo durante a maturação oocitária e avaliar sua interferência no metabolismo lipídico. Vias diferentes de síntese e degradação do GMPc serão estimuladas por drogas adicionadas aos meios de cultivo, tais como a Protoporfirina IX e peptídeo natriurético atrial (NPPA), que estimulam as enzimas de síntese de GMPc, guanilato ciclase (GC), e também o ODQ, inibidor da GC. Já a interferência na degradação será dada com sildenafil, inibidor seletivo da PDE5 e da PDE6 (enzimas de degradação específicas do GMPc), associado ao KT5823, inibidor seletivo da PKG que também inibe a fosforilação da PDE5 e sua atividade. Para a avaliação lipídica, será realizado um estudo comparativo entre os corantes mais utilizados para detecção de lipídios intracelulares, Nile red, BODIPY e Sudan Black B. A técnica mais eficiente no sistema, será selecionada para mensuração do teor lipídico dos oócitos oriundos dos CCOs submetidos aos tratamentos. Já as células do cumulus desses CCOs, serão destinadas a análises de expressão gênica para PLIN2, proteína que faz parte do proteoma das gotas lipídicas, avaliada mediante a técnica de qPCR-TR.