Caracterização de L-asparaginase de Erwinia chrysanthemi melhorada por evolução sintética de proteínas e otimização das condições de produção

Resumo

L-asparaginase (ASNase) é uma enzima tetramérica bacteriana, utilizada em sessões de quimioterapia que depletam Asparagina (Asn) e Glutamina (Gln), transformando-os em Aspartato (Asp) ou Glutamato (Glu), respectivamente, e em amônia. Contudo, a ASNase pode induzir resposta imune, levando à produção de anticorpos anti-asparaginase, a principal causa de resistência ao medicamento. Uma ASNase ideal seria aquela com alta atividade, alta estabilidade e baixo potencial alergênico, porém as ASNases comerciais hoje obtidas por Escherichia coli ou por Erwinia chrysanthemi não reúnem essas características simultaneamente. Por esta razão, o presente trabalho utiliza técnicas de mutagênese randômica e sítio-dirigida, a fim de criar uma nova isoforma de ASNase de E. chrysanthemi com uma melhor atividade e estabilidade em soro humano. Além disso, com auxílio de planejamento fatorial serão estudadas, em agitador metabólico, a linhagem mutante que expressar a melhor proteína recombinante de interesse, visando à otimização do processo de produção. Trata-se de uma conversão de projeto de mestrado para doutorado direto, uma vez que já foi obtido um número expressivo de mutantes promissores. Até o momento a atividade específica da enzima padrão foi estabelecida como 455 U/mg e foi criada uma biblioteca com 1.056 mutantes; desses, trinta clones foram selecionados por apresentar atividade de 80 a 200% do valor de atividade obtida para a enzima padrão. Dos trinta, quatro mutantes não apresentaram nenhuma mutação, sete mutantes apresentaram apenas mutações silenciosas e dezenove mutantes (64%) possuem pelo menos uma mutação na proteína. Esses 19 mutantes terão suas proteínas resultantes avaliadas quanto aos parâmetros cinéticos e citotoxicidade e as mais promissoras serão selecionadas para estudo das melhores condições e otimização de produção. (AU)