Investigação da relevância etiológica de novos genes candidatos às fissuras orofaciais

Resumo

As fissuras de lábio com ou sem fissura de palato não-sindrômicas (FL/P NS) são doenças complexas com forte determinação genética, e constituem o subgrupo mais comum das fissuras orofaciais, representando um importante problema de saúde pública. Os principais loci associados às FL/P NS são variantes comuns na população, que não respondem sozinhos pela sua alta herdabilidade. Assim, esta "herdabilidade perdida" vem sendo crescentemente explorada, bem como o papel etiológico de variantes raras, investigado principalmente por sequenciamento de exoma. Porém, estes estudos usualmente geram um número de variantes de significado clínico incerto ("VUS"), dentre as quais não é trivial identificar as variantes causativas da doença. Este projeto pretende estudar a contribuição etiológica de variantes raras em novos genes candidatos para as FL/P NS, utilizando, como ponto de partida, VUS previamente obtidas por nosso grupo em estudos de exoma de FL/P NS. Para isso, realizaremos análises de sequenciamento dos genes contendo as VUS em amostra expandida de pacientes e estudos funcionais em zebrafish (Danio rerio). Assim, propomos 3 objetivos específicos: 1- Determinar a contribuição etiológica destes novos genes candidatos, sequenciando-os em 300 pacientes em busca de novas variantes possivelmente patogênicas. Via teste de associação para variantes raras, investigaremos se há agregação destas nos pacientes, em comparação a 609 controles brasileiros. 2- Determinar funcionalmente a patogenicidade de VUS missense identificadas em nossos pacientes. Para tal, super-expressaremos, em embriões de zebrafish, mRNAs humanos com VUS de interesse e analisaremos alterações de desenvolvimento nas primeiras 48h. Como os genes abrigando as VUS em questão são expressos desde a embriogênese precoce, esperamos que as variantes patogênicas causem alguma perturbação no desenvolvimento. 3- Investigar o mecanismo genético responsável pela FL/P NS em decorrência de variantes raras no gene CDH1 (E-caderina), cujo papel etiológico foi corroborado em estudo do nosso grupo. Particularmente, testaremos a hipótese de que um mecanismo de dois hits no CDH1, um germinativo e outro somático durante a palatogênese, desencadearia a malformação. Para isso, utilizaremos uma linhagem disponível de zebrafish portadora de uma variante perda-de-função em heterozigose no gene ortólogo cdh1. Sabendo-se que o homozigoto é letal, super-expressaremos mRNA selvagem do cdh1 na prole de um casal heterozigoto, a fim de adiar a morte embrionária dos homozigotos, e analisaremos o fenótipo decorrente da falta de E-caderina durante o desenvolvimento craniofacial (a partir do quarto dia pós-fertilização). Também avaliaremos a hipótese de que o segundo hit seja decorrente de exposição a fatores ambientais adversos. Para testa-la, induziremos metilação do cdh1 em embriões heterozigotos, tratando o meio de crescimento de embriões com interleucina 1-beta, fator altamente correlacionado com metilação do promotor do cdh1, e analisaremos o fenótipo craniofacial. Por fim, caso as abordagens funcionais não se mostrem promissoras, realizaremos um nocaute dos genes candidatos, via edição genômica mediada por CRISPR/Cas9, condicional aos tecidos craniofaciais (a fim de evitar a possível letalidade embrionária dos peixes duplos-nocautes). Em suma, pretendemos ampliar o panorama conhecido de genes e variantes raras associados às FL/P NS e caracterizar os respectivos mecanismos genéticos envolvidos. Os resultados poderão auxiliar no desenvolvimento de diagnóstico preditivo, i.e., na identificação de indivíduos com risco de gerar filhos com FL/P NS por meio de testes moleculares, bem como avaliar a possibilidade de medidas preventivas, caso demonstremos a importância da epigenética na penetrância do fenótipo. Ainda, poderemos contribuir para estabelecer um método rápido de rotina para triagem de patogenicidade para VUS missense, obtidas por meio de análises genômicas de doenças craniofaciais. (AU)