Interação entre mastócitos e células endoteliais durante a angiogênese in vitro

Resumo

A angiogênese é um processo dinâmico que consiste na formação de novos vasos sanguíneos a partir de outros pré-existentes. Estudos recentes sugerem que a via de sinalização Notch pode regular o processo de neovascularização. O contato direto entre macrófagos e células endoteliais poderia ativar a via de sinalização Notch, resultando no espalhamento das células endoteliais. No entanto, ainda se desconhece os mecanismos que regulam este espalhamento, bem como, quais os demais tipos celulares envolvidos neste processo. Vários pesquisadores têm relacionado, funcionalmente, os mastócitos ao processo de angiogênese e o receptor Notch está expresso em mastócitos. Nossos estudos com células endoteliais da linhagem SVEC4-10 e mastócitos P815 demonstraram que as triptases mMCP-6 e 7 tem a capacidade de acelerar a formação de tubos e induzir a liberação de fatores pró e anti-angiogênicos. Na presença de rmMCP-7 é possível identificar no sobrenadante de células endoteliais durante angiogênese in vitro, o Dll-4 e ADAMTS1 (a desintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif). O Dll-4 é o receptor de Notch-1, porém, para a ativação da via Notch de sinalização é necessária a clivagem de Notch-1 por ADAMTS1. Estes achados nos levam a investigar se a via Notch/Dll4 também estaria envolvida nesta interação célula endotelial-mastócito. Para tal, primeiramente as células SVEC4-10 serão co-cultivadas com mastócitos P815 em Geltrex® e será avaliada a expressão do complexo Notch/Dll-4 por imunofluorescência durante angiogênese in vitro. Para verificarmos se a via Notch é necessária para o espalhamento e formação de tubos induzidos pelos mastócitos, o co-cultivo de SVEC4-10 com mastócitos P815, também será realizado após o silenciamento gênico de Notch e Dll-4. Nossos achados preliminares mostram que a rmMCP-7 pode degradar subunidades de integrinas o que facilita o deslocamento das células endoteliais no substrato. Para verificarmos se esta degradação de integrina ocorre direta ou indiretamente, realizaremos ensaios de degradação direta utilizando integrinas recombinantes e ensaios de degradação indireta bloqueando a via endossomal. A degradação indireta de integrinas via endossomos será investigada usando células SVEC4-10 incubadas com ou sem o inibidor de ubiquitinina/proteassoma, na presença rmMCP-7. Os resultados da angiogênese in vitro, induzida por rmMCP-7, será confirmado in vivo utilizando-se camundongos Balb/c e o sistema DIVAA" (Directed In Vivo Angiogenesis Assay). Os conhecimentos obtidos irão contribuir para o entendimento do processo de neovascularização e identificar moléculas que poderão servir de futuros alvos terapêuticos. (AU)