Avaliação do processo de regeneração muscular na Distrofia Muscular das cinturas tipo 2B

Resumo

A Distrofia Muscular de Cinturas 2B (DMC2B) é decorrente de mutações patogênicas no gene que codifica para a disferlina, uma proteína que atua na regeneração muscular e reparo de membranas. Estudos anteriores realizados pelo nosso grupo utilizando mioblastos humanos de um paciente DMC2B evidenciaram um prejuízo na diferenciação dos mioblastos em miotubos pela formação de miotubos menores e contendo menos núcleos, comparando a uma linhagem normal. Resultados nossos adicionais também mostraram que, em linhagens de camundongos distróficos, ocorria uma deficiência na maturação muscular. Estudos recentes têm identificado e relatado a atuação de novas proteínas envolvidas na fusão de mioblastos e nas etapas tardias de diferenciação do músculo, tais quais Myomaker, Myomixer, Palmdelphin e Obestatina/GPR39. Objetivos: investigar o efeito da ausência da proteína disferlina no processo de diferenciação e maturação das fibras musculares através da análise da expressão de genes e proteínas associadas ao processo. Metodologia: serão utilizadas linhagens de mioblastos humanos imortalizadas portadoras de diferentes mutações no gene DYSF e linhagens controle. Estas linhagens fazem parte de um consórcio internacional de estudos em pacientes com DMC2B. As células em cultura serão submetidas ao processo de proliferação e posterior diferenciação, e as análises serão realizadas em diferentes tempos de diferenciação. As amostras serão utilizadas para extração de RNA e proteínas, para análises de expressão gênica por qPCR e proteica, por western blot. Estudos por imunofluorescência serão utilizados para a análise qualitativa e de localização destes mesmos produtos proteicos. Nas células, também serão feitas análises morfométricas para avaliar parâmetros da diferenciação muscular, como diâmetro de miotubos e índice de fusão. Além disso, será investigada a formação de complexos proteicos envolvendo a disferlina e demais proteínas envolvidas na miogênese pela técnica de co-imunoprecipitação durante diferentes momentos da diferenciação. Caso possível, também será realizada a análise de modulação da expressão gênica das proteínas associadas à miogênese para avaliar um possível efeito terapêutico na DMC2B, e análise de transcriptoma e secretoma em diferentes momentos da diferenciação, na tentativa de identificar o perfil de expressão das células deficientes em disferlina durante o processo de diferenciação. Esperamos poder adicionar evidências que possibilitem melhor entender a importância e envolvimento da proteína disferlina na via de regeneração muscular, visando possibilidades terapêuticas a serem desenvolvidas. (AU)