Obtenção e caracterização bioquímica de metacaspases recombinantes de protozoários de interesse clínico

Resumo

O presente projeto de pesquisa é continuidade dos projetos anteriores realizado por nosso grupo de pesquisa, nos quais produzimos metacaspases de leveduras em sistema de expressão em E. coli em suas formas selvagens e contendo mutações sítio dirigidas. Interessantemente, as metacaspases de leveduras são classificadas como pertencentes do grupo I, que tem como característica apresentar sua região N-terminal constituída por resíduos apolares, rica em asparaginas, glutaminas e prolinas. A caracterização bioquímica destas enzimas é comprometida devido a insolubilidade delas, sendo necessário produzi-las sem seu N-terminal. Interessantemente, as metacaspases de protozoários, pertencem ao grupo II destas enzimas, que tem a característica de não apresentar a porção apolar em seu N-terminal, sendo solúvel e ativas em sua forma monomérica. Em trabalhos anteriores de nosso grupo já clonamos, realizamos mutações sítio dirigidas e caracterizamos bioquimicamente a metacaspase-2 de T.brucei (TbMCA-IIb). No presente projeto de pesquisa, pretendemos obter as metacaspases recombinantes de Trypanossoma cruzei, Leishmania amazonenses e Plasmodium falciparum, e com essas enzimas recombinantes pretendemos avaliar suas características físico-químicas, avaliando a interação de íons cálcio que são essenciais para a ativação e atividade das metacaspases, realizarmos a caracterização bioquímica completa dessas enzimas como ensaio com substratos sintéticos, estudo do pH e temperatura. Tal caracterização bioquímica será importante para que em futuros experimentos com colaboradores possamos testar e avaliar a ação de moléculas com a capacidade de modular a atividade das mecaspases, sendo de grande interesse para o desenvolvimento de novos fármacos contra essas doenças negligenciadas. (AU)