Investigação de interações RNA não-codificante-proteína em Leishmania (Viannia) braziliensis: identificando ligantes e avaliando os perfis de interação.

Resumo

Durante seu ciclo de vida, o parasito Leishmania precisa promover uma rápida mudança no perfil de expressão gênica para se adaptar às mudanças ambientais às quais é exposto. Os tripanossomatídeos não possuem promotores canônicos para a maioria de seus genes e, portanto, a regulação da expressão gênica resulta principalmente de processos pós-transcricionais. RNAs não codificadores de proteínas diferencialmente expressos (DE) (ncRNAs) foram identificados no transcriptoma das principais morfologias de Leishmania braziliensis sugerindo que podem desempenhar um papel na regulação da expressão gênica neste parasita. Usando genética reversa, investigamos o papel funcional de 10 ncRNAs longos DE (lncRNAs) no ciclo de vida de L. braziliensis. Os resultados obtidos mostraram que a deleção de 4 de 10 ncRNAs resultou em alterações em fenótipos do parasito como o crescimento das formas promastigotas, taxas de metaciclogênese e o tempo de duplicação das formas amastigotas. Além disso, observamos que esses lncRNAs sofrem diferentes tipos de processamento em relação à presença do spliced leader capeado e de cauda poli-A. Juntos, esses resultados indicam que esses elementos de fato existem em L. braziliensis e podem ter uma nova função reguladora neste parasita. Nosso objetivo agora é investigar as vias moleculares nas quais esses lncRNAs estão envolvidos. Para isso, estamos propondo a utilização de metodologias in vitro e in vivo para identificar os elementos que interagem com esses lncRNAs, e também desvendar como essas interações ocorrem a nível molecular. A produção de lncRNAs recombinantes para essas análises será feita in vitro, usando transcrição mediada pela T7 RNA polimerase, e in vivo, usando a metodologia inovadora de tRNA scaffold que permite a produção de RNA estável com alto rendimento e pureza para uso em ensaios pull-down e estudos estruturais. Pull-downs in vitro e in vivo também serão conduzidos para caracterizar o perfil de ligação das sequências de lncRNA contendo ou não mutações preditas como capazes de alterar a estrutura secundária desses elementos. Nossos resultados nos permitirão identificar vias potencialmente reguladas por esses lncRNAs e a relevância das estruturas secundárias e terciárias para a ligação proteína-lncRNA. (AU)