Development of DNA polymerases production process with high quality and processivity

• Grant number: 16/20162-3
• Support Opportunities: Scholarships in Brazil - Innovative Research in Small Business - PIPE
• Start date: October 01, 2016
• End date: October 31, 2017
• Field of knowledge: Biological Sciences - Biochemistry - Molecular Biology
• Principal Investigator: Amanda Bernardes Muniz
• Grantee: Amanda Bernardes Muniz
• Company: Cellco Biotec do Brasil Ltda
• Associated research grant: 16/00863-7 - Development of DNA polymerases production process with high quality and processivity, AP.PIPE

Abstract

As DNA polimerases são enzimas ubíquas capazes de sintetizar uma fita de DNA através da adição de desoxiribonucleotídeos a um DNA dupla fita iniciador, de acordo com um molde. É uma enzima amplamente empregada na manipulação in vitro do DNA, incluindo clonagem, sequenciamento e mutagêneses, entre outras técnicas. A DNA polimerase de Thermus aquaticus (Taq polimerase) é a enzima termoestável mais utilizada atualmente. Suas aplicações transcendem o uso em pesquisa, a exemplo do crescente emprego nas áreas de genotipagem e diagnóstica. Embora seja considerado um reagente básico para aplicações biotecnológicas, o mercado brasileiro é dependente de importações de DNA polimerases, obtendo-as com preços e prazos de entrega desfavoráveis. A Taq DNA polimerase recombinante, produzida em E. coli, apresenta características bioquímicas idênticas a proteína nativa de Thermus aquaticus com atividade, especificidade e termoestabilidade preservadas. A produção de Taq DNA polimerase recombinante é, portanto, possível e protocolos simplificados têm sido empregados em sua obtenção, especialmente, aqueles que exploram a sua natureza termoestável. No entanto, estudos recentes revelam a presença de DNA microbiano em várias preparações comerciais de DNA polimerases. Esta contaminação é um dos principais fatores limitantes do emprego da técnica de PCR para uso na detecção de DNA microbiano em amostras de ambiente ou de interesse médico. Adicionalmente, o aumento do desempenho das DNA polimerases é, frequentemente, alvo de projetos de engenharia de proteínas. O emprego de domínios proteicos fusionados tem apresentado resultados promissores na obtenção de polimerases com processividade elevada. Assim, este projeto busca o desenvolvimento do processo produtivo de Taq DNA polimerase capaz de aliar altos níveis de pureza e rendimento com a redução da contaminação com DNA microbiano. Adicionalmente, buscar-se-á a obtenção de uma enzima DNA polimerase quimérica, proveniente da fusão da Taq DNA polimerase com o domínio de ligação a DNA Sso7d, com elevada processividade reduzindo o tempo necessário para condução de reações de PCR rotineiras. As etapas envolvidas nesse processo consistem em: i. clonagem da construção fusionada da DNA polimerase de Thermus aquaticus e Sso7d de Sulfolobus solfataricus; ii. estabelecimento do sistema de expressão heteróloga em bactéria; iii. padronização do protocolo de produção e purificação da Taq e Sso7d-Taq; iv. caracterização das atividades das enzimas produzidas comparadas às demais polimerases disponíveis comercialmente. O resultado esperado para esta fase é a obtenção da enzima Taq polimerase e de sua versão fusionada com alta processividade, na forma ativa e livre de contaminação por DNA microbiano. A viabilização desse processo produtivo e do novo produto permitirão a produção com escala compatível com a comercialização e o acesso do mercado nacional à enzimas de alta qualidade, com um preço mais atrativo do que suas equivalentes importadas, além do desenvolvimento de uma tecnologia inédita no Brasil. Propõe-se, portanto, contribuir para o processo de nacionalização da produção de reagentes básicos de biologia molecular, favorecendo o fortalecimento e competitividade da pesquisa desenvolvida no Brasil no cenário mundial.