Technical support to the experimentation using alternative oxidase-expressing flies

• Grant number: 23/10380-7
• Support Opportunities: Scholarships in Brazil - Technical Training Program - Technical Training
• Start date: September 01, 2023
• End date: July 31, 2024
• Field of knowledge: Biological Sciences - Biochemistry - Metabolism and Bioenergetics
• Principal Investigator: Marcos Túlio de Oliveira
• Grantee: Ana Carolina Saito Fernandes da Cruz
• Host Institution: Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Jaboticabal. Jaboticabal , SP, Brazil
• Associated research grant: 21/06711-2 - Modulation of tissue growth and biomass accumulation by the mitochondrial alternative oxidase, AP.JP2

Abstract

Em Drosophila melanogaster, observamos que em casos de expressões de AOX em baixo nível ocorre a estimulação do crescimento tecidual, ao mesmo tempo que em altos níveis há a inibição deste crescimento e letalidade sob limitação nutricional. Nossa hipótese é de que a AOX força a transferência de elétrons através da cadeia respiratória. AOX não é encontrada de forma natural em vertebrados e insetos. Para avaliar seus efeitos em Drosophila melanogaster, utilizamos o sistema bipartido de expressão transgênica UAS/GAL4, que é formado pela elemento cis-regulatório UAS fundido ao gene codificador da AOX e pela proteína ativadora transcricional GAL4. Este sistema é uma ferramenta muito eficaz para avaliar e estudar não só a função, como também, a expressão gênica de forma direcionada, pois o fator de transcrição GAL4 pode ser tecido-específico e possui propriedades que ativam a transcrição de genes regulados por UAS. Tais componentes também não existem naturalmente em Drosophila, tendo sido isolado da levedura Saccharomyces cerevisiae e posteriormente inserido separadamente no genoma da mosca. Para que este sistema seja ativado, é necessário que a proteína GAL4 se ligue a sequência UAS, e para que isso aconteça é preciso que ambos componentes estejam no genoma de um mesmo indivíduo. Assim, se faz necessário a realização do cruzamento entre duas linhagens transgênicas, uma UAS-AOX e a outra daGAL4, para que seja possível observar e avaliar seus efeitos. O bolsista irá realizar atividades que irão contribuir para o desenvolver do projeto, principalmente no que tange a expressão de AOX no sistema UAS/GAL4, através da construção constante de cruzamentos para geração de larvas e adultos expressando a oxidase alternativa. Amostras de indivíduos expressando AOX servirão para experimentos de bioquímica, biologia molecular e microscopia confocal. O bolsista também realizará a manutenção das linhagens estoque do laboratório, selecionando os indivíduos adultos que constituirão a próxima geração, cuidando dos ovos e larvas, e realizando a expansão das linhagens para realização de experimentos. As atividades do bolsista ocorrerão de forma contínua, no qual, o mesmo sempre estará produzindo materiais para serem usados nos experimentos, como as moscas que expressam AOX por exemplo, como também, estará sempre realizando a manutenção das linhagens e auxiliando os demais membros do Laboratório de Biologia Mitocondrial do Departamento de Biotecnologia da UNESP-Jaboticabal, ao decorrer do projeto.