Utilização de shRNA anti-hexon e anti-IVa2 durante a produção de vírus adeno-associado como estratégia de eliminar adenovírus helper: Prova de princípio

Resumo

O Vírus Adeno-associado recombinante (rAAV) possui diversas vantagens que contribuem para a sua crescente aplicação na terapia gênica.O amplo tropismo, capacidade de transduzir células pós-mitóticas ou terminalmente diferenciadas, baixa frequência de integração, resposta imune moderada, alto título e expressão sustentada são características do rAAV que contribuem para a perspectiva de sua aplicação segura e bem sucedida em uma variedade de estratégias de terapia gênica. A produção de partículas de rAAV pode ser realizada por vários protocolos que, tipicamente, são muito difíceis de se realizar em larga escala. Isto se deve a complexidade da biologia do AAV e as adaptações que são incorporados nos vetores rAAV. Por exemplo, o uso de um vírus helper, como o Adenovírus, fornece fatores essenciais para a replicação do rAAV. Porém, a contaminação de estoques de rAAV com Adenovírus não é desejada e poderia prejudicar o uso do rAAV. Em outro exemplo, o uso do Adenovírus helper pode ser substituído pelo uso de um plasmídeo que codifica somente os fatores adenovirais minimamente necessários para apoiar a replicação do rAAV. Neste caso, a produção de rAAV envolve a co-transfecção de três plasmídeos (um que codifica o gene de interesse, outro que fornece genes rep e cap do AAV e o terceiro que fornece as funções helper). O problema com esta abordagem vem do procedimento de transição dos plasmídeos, um protocolo de difícilrealização em escala larga. A meta final desse trabalho é desenvolver um método de produção de vetor viral Adeno-associado independente da transfecção de plasmídeos e que minimize o risco de contaminar o estoque de rAAV com vírus helper. Nesta proposta atual, descreve-se ensaios de prova de princípio de que a utilização de RNAi contra os genes adenovirais hexon e IVa2 eliminaria a contaminação do estoque de rAAV com o adenovírus helper. O sucesso desta primeira etapa é crítico para futuramente construir um sistema aprimorado para a produção de rAAV que tambem não envolve transfecção de plasmídeos.