Estudos estruturais e cinéticos da enzima Desoxicitidilato desaminase (DEOC) de Schistosoma mansoni

Resumo

A esquistosomose é uma doença negligenciada que não atrai grandes investimentos de empresas do mercado farmacêutico na busca por potenciais fármacos. A enzima Desoxicitidilato desaminase (DEOC) é uma das enzimas do ciclo do timidilato do parasita Schistosoma mansoni causador da doença. Sendo esta uma das vias metabólicas essenciais do organismo, atuando na desaminação irreversível hidrolítica do deoxicitidina-5'-monofosfato (dCMP) para deoxiuridina-5'-monofosfato (dUMP) para prover o substrato para a Timidilato sintase, um passo fundamental na síntese de nucleotídeos estruturais (DNA e RNA) e energéticos (UTP). Esse trabalho tem como objetivo a determinação de um modelo cinético permitindo a longo prazo busca por possíveis inibidores e também a obtenção de um modelo estrutural que viabilize a compreensão das interações sítio específicas contribuindo assim com o aumento do conhecimento sobre as vias fundamentais do parasita. Para isso, será empregada a técnica de expressão heteróloga em sistema Escherichia coli BL21(DE3) do clone SmDEOC em vetor pET28a (Novagen), purificação por cromatografia por afinidade e exclusão molecular após a clivagem do His-TAG com trombina, validação através de SDS-PAGE e eletroforese nativa. Os ensaios cinéticos serão realizados por meio fluorimétrico monitorando a redução da absorção em 290 nm (comprimento de onda relacionado ao dCMP). A obtenção do modelo estrutural será empregando difração de raios-X em monocristal formado pelo método de difusão de vapor em gota suspensa. O cDNA de SmDEOC foi amplificado, a enzima recombinante expressa e caracterizada como um hexâmero estável em solução (118 kDa) pela análise do perfil cromatográfico e eletroforese na ausência de SDS e condições desnaturantes. Os primeiros ensaios de cristalização já apontam a condições favoráveis obtendo alguns cristais a serem testados. (AU)