Desenvolvimento de vetores não-virais de entrega gênica baseados na cadeia leve de Dineína Rp3

Resumo

Um dos principais obstáculos à ampla aplicação da terapia gênica e da vacina de DNA é a falta de um vetor ideal de entrega gênica, que seja ao mesmo tempo eficiente e seguro. Embora mais seguros, os vetores não-virais enfrentam uma série de barreiras físicas, enzimáticas e difusionais que limitam a chegada do transgene ao núcleo das células alvo. Dando continuidade ao trabalho desenvolvido em nosso grupo, o principal objetivo deste projeto é desenvolver e avaliar vetores não-virais multifuncionais baseados em proteínas recombinantes, e avaliá-los "in vitro" e também "in vivo". Nossa abordagem utiliza a proteína recombinante Rp3, uma cadeia leve de dineína, visando assim explorar a capacidade natural dos motores moleculares chamados dineínas para transportar cargas da periferia para o interior da célula, através da rede de microtúbulos. A Rp3 recombinante que será utilizada foi fusionada a peptídeos sintéticos, como seqüências de ligação ao DNA, um peptídeo membrano-ativo (TAT), além de uma sequência de histidinas. Com este trabalho, busca-se adquirir uma maior compreensão dos mecanismos envolvidos na entrada na célula e tráfego intracelular destes vetores. Combinando diferentes técnicas como espalhamento de luz, potencial zeta, ensaios de interação e transfecção na presença de drogas, além de microscopia confocal, poderemos correlacionar as propriedades físico-químicas do complexo proteína-pDNA com o tráfego intracelular e eficiência de entrega gênica. A transfecção de diferentes tipos de células de mamíferos nos permitirá avaliar a eficiência dos nossos vetores para realizar entrega gênica "in vitro", e finalmente, poderemos avaliar o potencial do nosso vetor através de ensaios "in vivo" (camundongos) em um modelo de fibrose cística, com os quais realizaremos experimentos de imunohistoquímica e quantificação da expressão do gene repórter. Esperamos, assim, aumentar o conhecimento atualmente disponível sobre o uso de proteínas recombinantes como vetores de entrega gênica. (AU)