Estabelecimento de uma metodologia baseada no sistema CRISPR/Cas9 para manipulação genética do fungo Moniliophthora perniciosa, causador da vassoura de bruxa do cacaueiro

Resumo

O cacaueiro (Theobroma cacao) é uma cultura perene de notável importância econômica mundial, sendo responsável pela geração de uma porção considerável das divisas nacionais. A produtividade da lavoura cacaueira no Brasil foi elevada e forneceu grandes benefícios ao país até o final dos anos 80, quando a doença vassoura de bruxa, causada pelo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa, foi introduzida nas plantações de cacau da principal região produtora do Brasil, o sul da Bahia. Como consequência, a agroindústria cacaueira local foi destruída, levando o Brasil da condição de exportador para a de importador de cacau e causando drásticos problemas de ordem social e ambiental na região. Uma vez que estratégias tradicionais de controle se mostram pouco efetivas para a doença, a melhor compreensão desta patologia torna-se essencial para o desenvolvimento de programas mais apropriados de combate. Importante progresso neste sentido vem sendo obtido com a análise do genoma de M. perniciosa e do atlas transcriptômico da vassoura de bruxa, que têm contribuído para a identificação e caracterização de múltiplos fatores relacionados à patogenicidade do fungo. Entretanto, estudos funcionais têm sido fortemente limitados pela ausência de uma metodologia para a manipulação genética de M. perniciosa, sendo este o principal gargalo atual no estudo da vassoura de bruxa. Tendo isto em vista, o presente projeto visa o estabelecimento de um procedimento para geração de linhagens knockout do fungo utilizando o sistema CRISPR-Cas9. Para isto, um cassete de inativação dirigido ao gene Mp-aox (codificador da enzima oxidase alternativa) será elaborado e utilizado na transformação de M. perniciosa. Tal gene do fungo já foi bem caracterizado por nosso grupo e recursos para avaliação fenotípica in vitro estão bem estabelecidos, sendo possível a validação das linhagens knockout de maneira simples e robusta. Uma vez estabelecido, o procedimento de manipulação genética em M. perniciosa poderá ser utilizado para produção de linhagens deficientes em inúmeros outros genes de interesse, constituindo-se em uma poderosa ferramenta para o estudo dos fatores envolvidos na patogenicidade de M. perniciosa. (AU)