Caracterização funcional, estrutural e modificação racional da ASPaseM: um novo fármaco para o tratamento da anemia linfóide aguda?

Resumo

L-asparaginases (L-ASPases) bacterianas são importantes biofármacos utilizados no tratamento de Leucemia Linfóide Aguda (LLA), uma vez que este tipo tumoral é dependente da disponibilidade de asparagina (Asn) extracelular. As L-ASPases bacterianas são capazes de hidrolisar eficientemente Asn em ácido aspártico (Asp) e amônia (NH3), diminuindo a disponibilidade de Asn para células tumorais e induzindo apoptose. Apesar de aparentar ser uma alternativa, as isoformas humanas não podem ser utilizadas no tratamento da LLA uma vez que o Km reside na faixa de milimolar, enquanto que as enzimas bacterianas apresentam Km ~7.5 × 10-6 M. Comercialmente, indústrias farmacêuticas internacionais produzem L-ASPases de Eschericchia coli e Erwinia chrysantemi, mas esse biofármaco não é produzido pelas indústrias farmacêuticas brasileiras. Neste contexto, fontes alternativas desta enzima e auto-suficiência em sua produção são importantes para evitar falhas no tratamento devido a flutuações internacionais de sua fabricação. Neste trabalho, temos como objetivo a caracterização de uma nova L-ASPase, denominada de ASPaseM que compartilha elevada homologia (> 30% de identidade e 40% de similaridade) com as enzimas bacterianas utilizadas no tratamento da LLA e que possui todos os aminoácidos envolvidos na catálise conservados, sugerindo uma fonte alternativa potencial para o tratamento da LLA. Temos como metas a caracterização estrutural por meio de cristalografia de raios-X de ASPaseM, bem como no engenheiramento da enzima visando melhorar suas características físico-químicas e farmacológicas. Inicialmente, serão padronizadas metodologias para sua expressão e purificação, ensaios funcionais de atividade enzimática para determinação dos parâmetros cinéticos da atividade de asparaginase e glutaminase e sua caracterização estrutural por meio de metodologias envolvendo espectroscopia de dicroísmo circular (CD), espalhamento dinâmico de luz (DLS), espalhamento de raios-X em baixo ângulo (SAXS) e cromatografia de exclusão molecular (SEC). Adicionalmente, serão realizadas abordagens de Engenharia Racional de proteínas com base na estrutura cristalográfica e mutações sítio dirigidas com o objetivo de produzir uma L-ASPase com características mais apropriadas para terapias, com acentuada atividade catalítica de asparaginase e atividade reduzida de L-glutaminase, mais estáveis e mais resistentes a proteólise em razão de maior empacotamento ou deleção de sítios proteolíticos. Durante todo o projeto será efetuada a cristalização de ASPaseM (e mutantes de interesse) e também a co-cristalização com ligantes (Asp, Glu ou succninato) visando a determinação de estruturas cristalográficas de ASPaseM ou mutantes, com ou sem ligantes no sítio ativo, visando um maior entendimento de aspectos funcionais. Adicionalmente, tanto ASPaseM quanto outras variantes carreando substituições de aminoácidos terão sua atividade antitumoral testada em células monocíticas REH provenientes de leucemia linfoblástica aguda (ATCCCRL-8286). O corrente projeto já conta com dados preliminares e estão apresentados no final da proposta. (AU)