Aplicação de CRISPR-interferência na elucidação da patogênese da leptospirose e desenvolvimento de novas estratégias para obtenção de mutantes knockout

Resumo

A leptospirose é uma zoonose de importância global recentemente incluída na lista das Doenças Tropicais Negligenciadas. Em áreas urbanas, os roedores desempenham o papel de principais reservatórios da doença por permitirem a colonização das leptospiras nos túbulos renais proximais e as excretarem vivas na urina. Segundo a Organização Mundial da Saúde, o número de casos clínicos anuais no mundo permanece subestimado. O melhor entendimento da patogênese da bactéria é um ponto crucial para o desenvolvimento de uma vacina eficaz. A geração de mutantes de Leptospira é uma peça chave na elucidação de fatores de virulência e da biologia básica da bactéria. Durante o desenvolvimento do Projeto de Pós-Doutorado (2017/06731-8 e BEPE 2019/20302-8), foi desenvolvida a ferramenta de CRISPR-interferência para silenciamento gênico epissomal e completo em estirpes saprofíticas e patogênicas, sendo que pela primeira vez na literatura espécies além de L. interrogans foram manipuladas. O sistema de CRISPRi desenvolvido requer a síntese constitutiva de uma proteína dCas9 ("dead" Cas9) e de um RNA guia (sgRNA), o qual direciona a proteína para os alvos de interesse, bloqueando a transcrição. Esta ferramenta tem se mostrado extremamente útil na elucidação in vitro e in vivo do papel de proteínas de Leptospira spp.. Neste contexto, nosso grupo apresenta inúmeros genes potenciais para silenciamento por esta técnica, sendo que com este período adicional, pretende-se aplicar e difundir a técnica de CRISPRi em nosso laboratório, bem como explorar estes alvos potenciais. Também pretende-se desenvolver novos plasmídeos para knockout genético, por meio da utilização da enzima Cas9 e co-expressão com proteínas de Mycobacterium tuberculosis que atuam no reparo da quebra genômica induzida pela enzima.