Identificação de fatores relacionados com fagocitose e sobrevivência de L. amazonensis por comparação de proteomas e análise de mutantes por CRISPR-Cas9

Resumo

A leishmaniose, complexo de doenças causadas por parasitos do gênero Leishmania, é endêmica em 98 países e tem incidência anual estimada em mais de 1 milhão de casos. A infecção sintomática pode apresentar formas clínicas cutânea, mucocutânea e visceral. No Brasil, três espécies dermotrópicas são predominantes, L. (V.) braziliensis, L. (L.) amazonensis e L. (V.) guyanensis. Durante seu ciclo de vida, o parasito se apresenta na forma promastigota, extracelular e transmitida pelo inseto vetor, e amastigota, intracelular no hospedeiro vertebrado. Leishmania expressa diversos fatores de virulência que influenciam em sua sobrevivência e infectividade. Mostramos que amastigotas das cepas PH8 e LV79 de L. (L.) amazonensis possuem diferenças na virulência em camundongos e no perfil proteico (proteoma). De forma semelhante, promastigotas da cepa PH8 têm maior adesão a macrófagos in vitro e maior internalização. A comparação dos proteomas de frações enriquecidas em membrana de promastigotas das cepas PH8 e LV79 mostrou diversas diferenças, e o perfil proteico foi capaz de discriminar parasitos das duas cepas. O presente projeto tem como objetivo validar as diferenças observadas nos proteomas e avaliar a importância funcional de algumas proteínas. Para isso, pretendemos gerar mutantes (knockout e/ou etiquetados) de enolase e LABCG1 por CRISPR-Cas9 e comparar a infectividade e fagocitose de parasitos mutantes com as das duas cepas selvagens. Pretendemos ainda avaliar a suscetibilidade de PH8 e LV79 a lise por complemento e a fármacos (no caso de ko para LABCG1), comparar seus LPGs e sua capacidade de colonização de flebotomíneos. (AU)