Resumo
Esta proposta investiga peroxidases de tiol em sinalização redox e defesa antioxidante por meio de cinco subprojetos interconectados.Subprojeto 1 examina a biologia química das enzimas Ohr em bactérias, com foco em interações hospedeiro-patógeno. Serão estudados os reguladores OhrRs, sua ligação ao DNA modulada por redox e a ação do composto 6-fluorobenzo[d]isotiazol-3(2H)-ona, que inibe o crescimento e induz mutações em Ohr de Acinetobacter baumannii. As abordagens incluem ensaios microbiológicos, estruturais, bioquímicos, lipidômicos e de virulência.Subprojeto 2 explora o eixo ácido ascórbico-ácido sulfênico (Cys-SOH) na sinalização por H¿O¿, em especial a redução de 1-Cys Prxs por ascorbato (vitamina C). Nossos dados mostram que o ascorbato reduz proteínas com cisteínas oxidadas a sulfenato com constantes de velocidade de ~10³ M¿¹s¿¹, sugerindo relevância em compartimentos celulares ricos em ascorbato. Os estudos envolverão Pseudomonas aeruginosa, Aspergillus fumigatus e Arabidopsis thaliana, utilizando ferramentas genéticas, bioquímicas e microbiológicas. Sondas geneticamente codificadas permitirão monitoramento em tempo real e não invasivo de H¿O¿ e da razão GSH/GSSG.Subprojeto 3 investiga o transporte e os papéis fisiológicos de Prxs de levedura e mamíferos do citosol para a na matriz mitocondrial e para o espaço intermembrana. Linhagens de levedura e células humanas nocaute serão usadas para estudar estados redox específicos de compartimento. Quimeras GFP identificarão presequências que direcionam Prxs à mitocôndria. Também exploraremos como a proteína PHB estimula a importação de Prdx3 em células de glioblastoma, em colaboração com o Dr. Oswaldo Keith Okamoto (IB-USP).Subprojeto 4 aborda a desregulação da sinalização por H¿O¿ em doenças, com foco na ferroptose, forma de morte celular induzida por peroxidação lipídica e contra-atacada por Gpx4. Em colaboração com o Dr. Friedmann Angeli (Universidade de Würzburg) e a Dra. Sayuri Miyamoto (IQ-USP), identificamos o 7-desidrocolesterol como supressor endógeno da ferroptose e revelamos papel essencial da Prdx6 no metabolismo de selênio e na função de Gpx4. Investigaremos as reações de transferência de selênio com CRISPR/Cas9, cromatografia e ensaios cinéticos, além de interações e mecanismos enzimáticos da Prdx6. A hiperoxidação de Prdx3 será avaliada como marcador de ferroptose.Subprojeto 5 utiliza Saccharomyces cerevisiae como modelo eucariótico versátil. O sistema robótico ROTOR+ e PIXL (FAPESP EMU 2022/11384-3) permite estudos em escala genômica, como SGA e BiFC. Trabalhos em andamento incluem a análise da Ahp1 (Prx atípica 2-Cys) na resposta ao estresse oxidativo durante elevada atividade peroxissomal. Outro estudo expressa o gene humano VAPB em levedura para investigar a mutação P56S associada à ELA8, que gera agregados citosólicos. Estamos examinando o papel da reticulofagia na resposta celular a esses agregados, com resultados preliminares obtidos pela mestranda Júlia Silvino.Em conjunto, esses subprojetos integram abordagens bioquímicas, genéticas e estruturais em diferentes modelos para revelar mecanismos fundamentais da biologia redox com relevância biomédica. (AU)
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