Optimization of simultaneous screening of the main mutations involved in non-syndromic deafness using the TaqMan® OpenArray" Genotyping Platform

• Processo: 13/22827-4
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Publicações científicas - Artigo
• Vigência: 01 de dezembro de 2013 - 31 de maio de 2014
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Genética - Genética Humana e Médica
• Pesquisador responsável: Edi Lúcia Sartorato
• Beneficiário: Edi Lúcia Sartorato
• Instituição Sede: Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG). Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Campinas , SP, Brasil
• Assunto(s): Genética médica Técnicas de genotipagem
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: deafness | Genetics | Genotyping | hearing loss | High-throughput | openarray | Genética Humana

Resumo

IntroduçãoA perda auditiva é o déficit sensorial mais comum em seres humanos, afetando cerca de 10% da população mundial. Nos países desenvolvidos, um em cada 500 indivíduos sofre de perda auditiva neurossensorial bilateral severa a profunda. Para aqueles com até cinco anos de idade, a proporção é maior, sendo de 2,7 em 1000 indivíduos e para os adolescentes a média é de 3,5 em 1000. Entre as causas da perda auditiva, mais de 50% estão relacionadas a fatores genéticos. Até o momento, cerca de 150 loci e 64 genes foram associados com perda auditiva, sendo as mutações no gene GJB2, que codifica a conexina 26, as que constituem a principal causa genética. Até agora, mais de 300 alterações foram descritas neste gene. Como resposta à heterogeneidade clínica e genética da surdez e da importância do diagnóstico molecular correto de indivíduos com perda auditiva hereditária, este trabalho objetivou a otimização de um protocolo de diagnóstico empregando uma tecnologia de genotipagem de alto rendimento (high-throughput).MétodosPara este trabalho, foi utilizado a plataforma de genotipagem TaqMan® OpenArray"(BioTrove Inc. , Woburn , MA, EUA). Esta é uma plataforma de alto desempenho e rendimento baseada em PCR em tempo-real que permite a avaliação de até 3.072 SNP (Single Nucleotide Polymorphisms), mutações pontuais, pequenas deleções e inserções , utilizando uma única placa de genotipagem. Para o estudo, foi selecionado o layout que permite analisar 32 alterações em 96 indivíduos simultaneamente. No final, os resultados gerados foram validados por meio de técnicas convencionais, como sequenciamento direto, PCR Multiplex e RFLP-PCR.ResultadosUm total de 376 indivíduos foram analisados, dos quais 94 eram controles ouvintes , totalizando 4 placas em duplicata. Todas as 31 alterações analisadas estavam presentes nos genes nucleares GJB2 , GJB6 , CRYL1 , TMC1 , SLC26A4 , miR-96 e OTOF; e nos genes mitocondriais MT-RNR1 e MT-TS1. As reações foram posteriormente validados por técnicas previamente estabelecidas (sequenciamento direto, PCR multiplex e RFLP-PCR ), empregadas na triagem molecular de perda auditiva no Laboratório de Genética Molecular Humana do Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG), da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). No total, 11.656 reações de genotipagem foram realizados. Destas, apenas 351 reações falharam, o que representa cerca de 3,01 % do total. Assim, a taxa de acurácia média de genotipagem utilizando as placas OpenArray" foi de 96,99%.ConclusõesOs resultados demonstraram a acurácia, o baixo custo e a fácil reprodutibilidade da técnica, indicando que a plataforma de genotipagem TaqMan® OpenArray " é, além de inovadora, uma ferramenta útil e confiável para aplicação em testes de diagnóstico molecular de perda auditiva. (AU)