Padronização da técnica de Western Blotting para quantificação proteica após superexpressão do gene da enzima PIPKIIa em culturas de células eritroides humanas

• Processo: 15/04179-0
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de abril de 2015
• Data de Término da vigência: 31 de dezembro de 2015
• Área de conhecimento: Ciências da Saúde - Medicina - Anatomia Patológica e Patologia Clínica
• Pesquisador responsável: Maria de Fatima Sonati
• Beneficiário: Thais Traina Jorge
• Instituição Sede: Faculdade de Ciências Médicas (FCM). Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Campinas , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 14/00984-3 - Doenças dos glóbulos vermelhos: fisiopatologia e novas abordagens terapêuticas, AP.TEM
• Assunto(s): Células eritroides Superexpressão gênica Western blotting Enzimas
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: celúlas eritróides | Pipkiia | superexpressão | Western Botting | Hematologia Clínica

Resumo

O Western Blotting (WB) é uma importante ferramenta de Biologia Molecular para estudo de proteínas, sendo considerada altamente sensível e específica. Quando ligadas a membranas, as proteínas são detectadas, caracterizadas e quantificadas por ensaios imunológicos. O protocolo de WB envolve seleção do método apropriado, do aparato a ser utilizado, das membranas, tampões e condições de transferência. O objetivo do presente projeto é padronizar a técnica de WB para quantificação da proteína PIKIIA e das globinas alfa, beta e gama, após a superexpressão, através da tecnologia da ativação por RNA (RNAa), do gene da enzima PIPKIIA em cultura de células eritróides humanas. Assim sendo, células CD34+ transduzidas por vetores lentivirais serão lisadas e terão suas proteínas extraídas e mensuradas através da técnica de WB a ser padronizada. As análises proteicas, realizadas através desta técnica, terão por finalidade estimar as quantidades relativas da PIPKIIA e das cadeias globínicas, após o procedimento da superexpressão gênica, correlacionando-se os resultados com aqueles obtidos no qPCR. Ao final, esperamos com todos estes experimentos observar uma possível relação entre a PIPKIIA e a produção de globinas em células eritróides, na tentativa de contribuir para a elucidação das funções desta enzima e avaliar o papel desta na regulação (direta ou indireta) dos genes de globinas.