Estudo in vitro da sensibilidade ao IGF-1 de fibroblastos de crianças nascidas pequenas para a idade gestacional sem recuperação estatural pós-natal

Autor(es)

Luciana Ribeiro Montenegro

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: São Paulo.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Medicina (FM/SBD)
• Data de defesa: 2009-05-22

Membros da banca

Alexander Augusto de Lima Jorge; Sonir Roberto Rauber Antonini; Maria Lucia Cardillo Correa Giannella; Cristiane Kochi; Mirian Yumie Nishi

• Orientador: Alexander Augusto de Lima Jorge

Resumo

Introdução: Crianças nascidas pequenas para a idade gestacional (PIG) apresentam maior risco de permanecerem com baixa estatura na vida adulta. Os fatores de crescimento insulino-símile tipo 1 e 2 (IGF-1 e IGF-2) são os principais fatores endócrinos determinantes do crescimento fetal. A maioria das ações conhecidas do IGF-1 e 2 é mediada via um receptor tirosina quinase, conhecido como IGF-1R. Recentemente, a insensibilidade ao IGF-1 foi identificada como uma das causas de retardo de crescimento em crianças nascidas PIG que não apresentaram recuperação espontânea do crescimento na vida pós-natal. Crianças afetadas apresentavam níveis elevados de IGF-1, IGFBP-3 além de microcefalia. O papel de defeitos pósreceptor na sinalização do IGF-1 como causa de retardo de crescimento pré e pós-natal ainda não foi investigado. Objetivo: Analisar in vitro a ação do IGF-1 em fibroblastos de crianças nascidas PIG. Material e métodos: Desenvolvemos cultura de fibroblastos de 2 controles (C1 e C2) e de 4 pacientes nascidos PIG (SGA1, SGA2, SGA3 e SGA4) com suspeita de insensibilidade ao IGF-1 por ausência de recuperação do crescimento na vida pós natal, resposta insatisfatória ao tratamento com hGH apesar de níveis normais/elevados de IGF-1. Foi confirmado do ponto de vista molecular que um dos pacientes (SGA1) apresenta Síndrome de Sílver- Russell com perda da metilação do alelo paterno da região ICR1 (imprinting center region 1) importante para a expressão do IGF-2. Defeitos no gene do IGF1 e IGF1R foram afastados por sequenciamento direto. As ações do IGF- 1 foram determinadas por ensaios de proliferação, análise da produção de IGFPB-3 em meio de cultura e estudos de fosforilação de proteínas da via de sinalização do IGF-1 em fibroblastos (AKT e ERK). Resultados: As linhagens SGA1, SGA2 e SGA3 proliferaram respectivamente 31%, 60% e 78% a menos sob estímulo de IGF-1 em relação ás linhagens controles. Já a linhagem SGA4 apresentou comportamento semelhante ás linhagens controles. No estudo da expressão do RNAm do IGF1R por PCR em tempo real, não foi observada diferença significativa na expressão do IGF1R nas diversas linhagens PIG em relação aos controles, assim como o conteúdo total da proteína IGF-1R. Em relação á ativação da via MAPK, todas as linhagens dos pacientes PIGs apresentaram menor fosforilação ERK1/2 basal e após estímulo com IGF-1, quando comparadas com as linhagens controles (p < 0.001) apesar do conteúdo total de ERK1/2 ser semelhante. Já em relação a ativação da via PI3K, as linhagens SGA1, SGA2, SGA3 e SGA4 não diferiram significantemente em relação aos fibroblastos controles quanto à ativação de AKT pelo IGF-1. O conteúdo total de AKT também foi semelhante em todas as linhagens estudadas. O estudo da expressão de IGFBP3 mostrou um aumento da expressão deste peptídeo na linhagem de fibroblastos do paciente SGA1 (14X). O conteúdo de IGFBP-3 intracelular não sofreu alteração, porém comprovamos que a linhagem SGA1 secretava 2x mais IGFBP-3 para o meio de cultura. Apesar de apresentarem estrutura, expressão e conteúdo de IGF1R normais, essas mesmas 3 linhagens celulares que apresentaram menor proliferação também apresentaram diminuição na fosforilação de ERK após tratamento com IGF-1. Mesmo sob o estímulo com desIGF-1 (um análogo do IGF-1 com baixa afinidade por IGFBPs mas que preserva sua capacidade de ativar o receptor IGF-1R) a ativação de ERK e a proliferação celular se manteve abaixo dos das linhagens controles. O estudo do conteúdo total de GRB10 foi semelhante em todas as linhagens celulares. Conclusão: Três dos 4 pacientes PIG estudados apresentaram insensibilidade pós-receptor ao IGF-1. A linhagem celular SGA1, obtida de um paciente com hipometilação do ICR1 11p15 causando SSR, demonstramos um aumento da expressão e secreção de IGFBP-3, o qual não se mostrou responsável por inibir a ação do IGF-1 nestes fibroblastos. Novos estudos devem ser desenvolvidos para identificar o defeito molecular responsável pela insensibilidade ao IGF-1 a nível pósreceptor observada nestes pacientes. (AU)

• Processo FAPESP: 05/50144-2 - Determinação da sensibilidade ao IGF-1 de fibroblastos de crianças nascidas pequenas para a idade gestacional
• Beneficiário: Luciana Ribeiro Montenegro
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto