Aproximação genômica e pós-genômica ao estudo das malárias humanas de Plasmodium vivax e Plasmodium falciparum na Amazônia brasileira

Resumo

Apesar dos enormes esforços de pesquisa, a malária permanece sendo a doença parasitária mais devastadora da humanidade, com cerca de 200-300 milhões de casos anuais e entre 1,7 e 2,4 milhões de mortes, principalmente em crianças com idade abaixo de cinco anos. No Brasil, a Região Amazônica é responsável por quase todos os casos clínicos de malária, mais de 600.000 no ano passado, com uma perda econômica estimada em 100-200 milhões de dólares. É interessante que as espécies mais prevalentes de parasitas da malária, Plasmodium falciparum e P. vivax, são simpátricas na Amazônia Brasileira, oferecendo uma oportunidade única para os estudos comparativos. Em 1997, um Consórcio Internacional compreendendo o Centro Sanger, o TIGR e a Universidade Stanford lançou o Projeto Genoma de P. falciparum. Nesse mesmo ano, relatou-se a construção de uma biblioteca genômica representativa de P. vivax, iniciando-se em sentido estrito a era genômica das pesquisas sobre a malária humana. A finalização do genoma de P. falciparum, bem como avanços significativos no genoma de P. vivax, foram recentemente anunciados no 11th Meeting of the Malaria Genome Consortium (Hinxton, 5-6 de junho de 2001). Propomos aqui o uso de abordagens genômicas e pós-genômicas em três áreas principais de pesquisa em malária, em que temos trabalhado, com o uso de outras abordagens metodológicas, ao longo dos últimos dez anos: fatores de virulência, genética de populações e quimioterapia. Além disso, através da integração com o Centro de Bioinformática da USP, propomos a criação de um banco de dados de seqüências e imagens de microarrays (MalDB) para explorar de modo completo toda essa nova informação biológica. Virulência: O seqüenciamento das regiões subteloméricas de P. falciparum e P. vivax revelou a existência de famílias multigênicas que codificam potenciais determinantes de virulência. Propomos a determinação do repertório genômico destas famílias multigênicas, em isolados da Amazônia brasileira, através do seqüenciamento de aproximadamente 10 Mpb de parasitas obtidos de pacientes infectados em diferentes regiões. Com esta informação, serão construídos microarrays contendo "todo" o repertório brasileiro de genes de virulência de P. vivax e P. falciparum, a serem usados na determinação dos padrões de expressão em pacientes com diferentes manifestações clínicas da infecção, incluindo-se aqui amostras de parasitas da África e Ásia. Esses resultados devem revelar padrões de expressão associados com pacientes sintomáticos e assintomáticos, e padrões associados às formas graves com comprometimento renal e pulmonar encontradas principalmente no Brasil. Alem disso, a análise das seqüências expressas poderão revelar motivos conservados que servirão de base para abordagens racionais futuras visando ao desenvolvimento de novas vacinas e/ou drogas anti-maláricas. Genética de populações: O conhecimento da complexidade genética em populações de P. vivax e de P. falciparum da Amazônia brasileira é relativamente limitado. Propomo-nos a gerar marcadores de microssatélites para P. vivax, e a utilizá-los juntamente com aqueles já descritos para P. falciparum, para determinar a complexidade genética dessas duas espécies na Amazônia brasileira. Além disso, será gerado um mapa de mutações pontuais (SNPs) em uma região do cromossomo 2 de P. falciparum que contém os loci antigênicos msp2, msp3 e msp4, bem como do cromossomo 9 contendo o locus antigênico msp1, para determinar a freqüência de recombinação meiótica em populações naturais de parasitas. Sem um conhecimento aprofundado desses parâmetros, quaisquer intervenções futuras de natureza de controle, tais como vacinas ou novas drogas, estarão seriamente comprometidas e colocarão em risco a disposição das populações de áreas endêmicas brasileiras de participarem como voluntárias em diferentes ensaios clínicos. Novos alvos de drogas. O seqüenciamento completo do genoma de P. falciparum foi concluído, e um conjunto de oligonucleotídeos representando todos os 6.000 genes está disponível no mercado. Portanto, propomo-nos a construir um microarray de P. falciparum para descobrir novos alvos de drogas concentrando-nos inicialmente em drogas cujo alvo é a via dos isoprenóides. Uma vez que esta via está restrita a uma organela única dos plasmódios, o apicoplasto, ela vem sendo muito estudada ao longo dos últimos anos. Os genes que apresentarem sua expressão significativamente alterada após o tratamento com as drogas selecionados, serão posteriormente inativados (knocked out) para determinar quais são essenciais. Utilizaremos também outra organela do parasita, o acidocalcissoma, como um novo alvo para o desenvolvimento de drogas. Ao contrário do apicoplasto, não há informação básica sobre o acidocalcissoma. Propomo-nos a determinar a estrutura molecular completa desta organela utilizando principalmente enfoques de espectrometria de massa. Esta informação será utilizada para testar drogas que potencialmente afetem esta organela de modo específico, tanto in vivo como in vitro. No futuro, os dados obtidos com inibidores específicos destas duas organelas, serão utilizados para o desenvolvimento racional de novas drogas antimaláricas. Banco de dados e de imagens de malária (MaIDB). O armazenamento e uso de toda a informação a ser gerada através deste projeto requerem um importante aporte da bioinformática para a sua exploração e mineração. Propomo-nos assim criar um banco de dados e imagens de malária (MaIDB) no Centro de Bioinformática da USP. A existência deste banco servirá a um propósito duplo. Em primeiro lugar, garantir o armazenamento adequado e a recuperação mais efetiva da informação biológica gerada neste projeto. Em segundo lugar, desenvolver ferramentas de bioinformática específicas para seqüências e imagens de microarrays de plasmódios, um campo que está em sua infância e traz a promessa de acelerar a descoberta de estratégias alternativas de controle. Acreditamos que a proposta aqui apresentada, utilizando as abordagens genômica e pós-genômica no estudo das duas espécies mais prevalentes de parasitas de malária no Brasil, merece figurar entre as prioridades de financiamento da F APESP. Além disso, apesar de representar grandes perdas sócio-econômicas para o país, infelizmente há uma tendência nacional de diminuição na pesquisa biomédica em malária (1). Em contraste, há internacionalmente uma tendência oposta, que inclui um aumento significativo de financiamento à pesquisa em malária. A interação de 7 pesquisadores de malária com 3 pesquisadores de ciências da computação permitirá um crescimento vertical de conhecimento em diversas áreas, incluindo a área de bioinformática. Isto proporcionará, ao fim deste projeto temático, as bases para uma futura abordagem biotecnológica e racional no desenvolvimento de novas drogas, vacinas ou estratégias alternativas de controle da doença.1. Rodrigues OS, Fonseca L & Chaimovich H. 2000. Mapping câncer, cardiovascular and malaria research in Brazil. Brz J Med Biol Res, 33: 853-867. (AU)